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蜡质芽孢杆菌(Bacillus cereus)AR156作为植物根围促生细菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacterium,PGPR),最主要的作用机制是诱导植物产生系统诱导抗病性(induced systemic resistance,ISR),有效防治多种病害。小分子RNA是植物参与防卫反应的关键调节因子,课题组前期发现miR825/825*负调控AR156诱导拟南芥产生的ISR。本文主要探究miR825的靶标基因At5G44940和miR825*的靶标基因At5G38850、At3G04220、At5G40910在AR156介导的拟南芥ISR中的作用,以便进一步深入研究miRNA参与ISR的作用机制。小分子RNA与Argonaute(AGO)蛋白在植物与病原菌的相互作用中发挥重要的调节作用。已有实验证明OsAGO18参与水稻抗病毒防卫反应。本研究利用酵母双杂交和亲和纯化技术筛选水稻OsAGO18的互作蛋白,为深入研究OsAGOs参与植物防卫反应的分子机制提供基础。本文主要内容如下:1、miR825/825*靶标基因在AR156诱导拟南芥抗病中的功能。ISR是植物响应病原菌侵染的一种有效的防卫反应,而植物内源小分子RNA参与调控ISR的机理尚不明晰。本研究以AR156为生防菌,以拟南芥为模式植物,以灰霉病灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonay pv.tomato DC3000)为模式病原,进行互作研究,探究AR156的生防机理。本实验首先通过AR156对拟南芥灌根预处理后接种B.cinerea,发现AR156能够诱导拟南芥产生有效的ISR来抵抗死体营养型病原菌灰霉菌的侵染,进一步揭示了 AR156介导植物产生对多种病原菌的诱导抗病性的作用机制。前期研究表明,AR156可以通过抑制miR825和miR825*的表达,激活其靶标基因,参与下游防卫反应,从而介导拟南芥产生抵抗细菌的ISR。为深入研究miR825/825*靶标基因参与AR156诱导ISR的调控机制,本研究选取miR825的靶标基因At5G44940(泛素蛋白连接酶)和miR825*的靶标基因At5G38850(R 基因,TIR-NBS-LRR 类)、At3G04220(R 基因,TIR-NBS-LRR 类)、At5G40910(R基因,TIR-NBS-LRR类)的T-DNA插入突变体,使用AR156灌根预处理Col-0野生型和这四种缺失突变体后接种Pst DC3000,通过致病性测定、防卫基因的表达、ROS积累和胼胝质沉积检测发现,这四种靶标突变体对Pst DC3000的抗性较Col-0野生型减弱;AR156预处理能够提升这四种靶标突变体对Pst DC3000的抗性。综上所述,miR825/825*靶标基因参与AR156诱导拟南芥抵抗细菌侵染的ISR。2、水稻OsAGO18互作蛋白的筛选与鉴定。本文通过研究OsAGO18与其互作蛋白之间的关系,旨在进一步探究OsAGO18参与植物抗病反应的作用机制。本研究尝试了利用酵母双杂交技术,构建水稻日本晴cDNA文库,筛选诱饵蛋白OsAGO18的互作蛋白。在酵母筛选培养基上初步筛选得到的70个酵母单菌落。后期一对一酵母双杂互作验证结果显示这些蛋白并非真正与OsAGO18互作的蛋白。因此本实验又使用了免疫共沉淀结合液相色谱-串联质谱的方法鉴定了 OsAGO18物理互作蛋白。共得到257个互作蛋白。我们对其中的8个候选蛋白(蛋白翻译起始因子OsIF4A1、OsIF3G;延伸因子OsEF1D1;抗坏血酸过氧化物酶OsAPX2;14-3-3类似蛋白OsGF14F;超氧化物歧化酶OsSODA1;热激蛋白OsHAP81-3;过氧化氢酶OsCatA)进行了结构分析,并通过Co-IP方法验证了 OsIF4A1与OsAGO18的互作关系。该成果为后续研究OsAGO18的功能提供基础。