心血管疾病是引起人类死亡的头号杀手,而高血压是引起脑卒中、肾脏衰竭、心肌梗死等心血管疾病的主要诱因,控制好高血压,有利于降低心血管疾病的发病率。目前,化学合成的血管紧张素转移酶(ACE)抑制剂是治疗高血压疾病重要的一类临床药物。食物蛋白源ACE抑制肽具有来源广泛、无毒副作用、降压效果好、安全系数高等特点,具有广阔的应用价值。本课题以核桃蛋白Alcalase酶解液为研究对象,采用多种分离纯化技术,鉴定出两种ACE抑制率较高的多肽,并对其性质进行研究,为核桃蛋白源ACE抑制肽的开发应用提供实验基础和理论依据。本课题的主要研究结论:(1)分子排阻色谱纯化核桃蛋白源ACE抑制肽条件优化。结果表明,以Sephadex G-15为分离介质的色谱优化条件为:超纯水为洗脱剂,洗脱流速0.4 m L/min,上样体积1.5 m L,样品浓度150 mg/m L。在此条件下,经分子排阻色谱纯化后,得到4个主要组分,其中组分G4的ACE抑制率最高,达到90.35%,其IC50值为0.158 mg/m L。经过RP-HPLC进一步分离,高活性组分保留时间主要集中于10 min、13 min、16-18 min和21 min,经氨基酸分析仪测定发现疏水性氨基酸的含量得到显著富集,其中芳香族氨基酸Tyr、Phe的含量分别达10.46%和20.15%。(2)半制备型和分析型两次液相色谱法纯化核桃蛋白源ACE抑制肽。利用半制备液相分离纯化后得到六个组分,其中组分C的ACE抑制率最高。分析型液相色谱对组分C进一步分离纯化,得到五个组分,其中组分C3的ACE抑制率最高。(3)核桃蛋白源ACE抑制肽结构鉴定及化学合成。通过液质联用技术(UPLC-MALDI-TOF/MS)鉴定C3组分的结构,鉴定出两种ACE抑制肽,氨基酸序列分别为Leu-Tyr(LY)和Tyr-Leu-Ala(YLA),其相对分子质量分别为295.19 Da和366.24 Da。采用固相合成的方法合成肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala,测定其IC50值,分别为42μmol/L和396μmol/L,均具有较强的ACE抑制效果。(4)核桃蛋白源ACE抑制肽性质研究。肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有较强的热稳定性,在80℃条件下加热3 h,保存率均在80%以上。同时多肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有较强的抗消化性:在人工胃液条件下,多肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有良好的抗胃蛋白酶消化性,反应5 h后,多肽的保存率为85%;在人工肠液条件下,肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala具有良好的抗胰蛋白酶消化性,反应5 h后,肽的保存率为80%。实验对肽Leu-Tyr和Tyr-Leu-Ala的抗氧化活性进行了研究,结果发现肽Tyr-Leu-Ala的抗氧化能力较弱,但是肽Leu-Tyr在浓度为1.00 mg/m L条件下,对ABTS自由基的清除能力高达76.4%,是相同条件下还原性谷胱甘肽(GSH)清除能力的75.2%,说明ACE抑制肽Leu-Tyr同时具有较强的ABTS自由基清除能力。(5)核桃蛋白源ACE抑制肽抑制动力学研究。肽Tyr-Leu-Ala对ACE的抑制为非竞争性抑制类模型,即无论底物是否存在,肽Tyr-Leu-Ala都可以与ACE结合,通过改变ACE酶的构象,抑制其活性,并且在低浓度和高浓度条件下均有较好的抑制作用。