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研究背景:慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系统疾病中严重危害人类健康的常见病和多发病。《慢性阻塞性肺疾病全球倡议(GOLD)2020》中,定义COPD是一种常见,可预防、可治疗的疾病,其特征为持续性呼吸道症状以及气流受限,这是由于气道和/或肺泡异常所致,通常因为大量暴露于有毒气体或颗粒且受宿主因素的影响。世界卫生组织(WHO)于2019年10月14日公布:随着吸烟在发展中国家日益流行和高收入国家人口老龄化,COPD的患病率预计将在未来40年内不断上升,到2060年,每年可能约有540多万人死于COPD及其相关疾病。COPD在中国成年人中高度流行,是第三大致死原因。线粒体损伤在COPD中的潜在机制,已日益被认为是一个重要的研究领域。线粒体功能和数量的动态平衡在肺损伤后的细胞生物合成、肺泡上皮的稳态和组织再生中起重要作用。线粒体完整性是由复杂的调控机制调节的,包括线粒体的生物合成、融合和分裂动力学以及自噬降解过程。其中,线粒体自噬在线粒体的质量控制中起重要作用。线粒体质量控制是决定细胞命运的关键因素之一,与衰老、凋亡、程序性坏死等细胞命运密切相关。但在COPD中线粒体损伤导致细胞死亡的确切机制仍是未知的。研究目的:本实验选用大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞株(RLE-6TN)作为研究材料,重点研究了香烟烟雾提取物(Cigarette smoke extract,CSE)对RLE-6TN细胞线粒体结构、功能的影响和线粒体自噬现象,以及检测其对RLE-6TN细胞命运转归的影响。萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)是一种强效的Nrf2激动剂,通过Nrf2-ARE途径上调谷胱甘肽水平,被证明是强大的抗氧化剂,我们用SFN来抑制细胞线粒体损伤,观察了细胞结局的变化,拟进一步揭示COPD的发病机制。研究方法:1.实验分组:根据培养条件及不同的处理分为以下4组:(1)Control组:正常培养RLE-6TN细胞;(2)CSE组:5%CSE处理RLE-6TN细胞12小时;(3)CSE+SFN组:5μM SFN预处理RLE-6TN细胞12小时后,5%CSE处理12小时;(4)CSE+NAC组:5%CSE和1 m M NAC共处理RLE-6TN细胞12小时。2.细胞内ROS的检测:采用荧光探针2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate,DCFH-DA)经流式细胞术检测细胞内ROS的产生。3.线粒体膜电位检测:以JC-1为荧光探针,通过流式细胞术检测RLE-6TN细胞线粒体膜电位的变化。4.线粒体形态和分布的检测:用Mitotracker Red对线粒体进行染色,于激光共聚焦显微镜下观察细胞线粒体形态和分布的变化。5.采用Annexin V-FITC/PI双染RLE-6TN细胞,并通过流式细胞术检测细胞凋亡情况。6.细胞周期检测:细胞经PI染料染色后,流式细胞术检测细胞周期。7.采用Caspase 9活性检测试剂盒测定RLE-6TN细胞内Caspase 9的活性。8.采用SA-β-半乳糖苷酶染色,观察细胞衰老情况。9.Western blotting法检测RLE-6TN细胞内线粒体动力相关蛋白Drp1和p-Drp1的表达水平;自噬相关蛋白LC3和线粒体自噬相关蛋白p-PINK1的表达水平;线粒体凋亡途径相关蛋白Caspase 9、Caspase 3、P53、Bcl 2和Bax的表达水平;程序性坏死相关蛋白p-MLKL的表达水平。研究结果:1.CSE能增加RLE-6TN细胞内ROS的水平。采用荧光探针DCFH-DA进行检测,流式检测结果显示:CSE能诱导RLE-6TN细胞产生ROS(P﹤0.05),SFN和NAC处理后能显著改善这种情况。2.CSE可诱导RLE-6TN细胞线粒体膜电位(MMP)下降。JC-1染色后流式检测MMP,结果显示:CSE能诱导RLE-6TN细胞线粒体膜去极化而降低线粒体膜电位。3.CSE可影响RLE-6TN细胞线粒体的形态以及分布。用Mitotracker Red对线粒体染色后,于激光共聚焦显微镜下观察到:CSE作用后,RLE-6TN细胞线粒体呈碎片状,并出现核周聚集现象。Western blotting检测结果显示,CSE处理后,Drp1蛋白的表达并未发生改变,而p-Drp1(S616)的蛋白表达水平升高,表明CSE能够诱导RLE-6TN细胞线粒体分裂。4.CSE能影响RLE-6TN细胞线粒体自噬相关蛋白的表达。Western blotting检测结果显示,CSE可以提高细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ的比值和p-PINK1的表达量,结合线粒体形态学改变,提示CSE能诱导RLE-6TN细胞发生线粒体自噬。5.CSE诱导RLE-6TN细胞发生凋亡。使用Annexin V-FITC/PI对细胞进行双染,流式检测结果显示:CSE能诱导RLE-6TN细胞凋亡(P﹤0.05)。SFN和NAC均可缓解CSE诱导的细胞凋亡。6.CSE诱导RLE-6TN细胞以线粒体凋亡途径发生凋亡。Caspase 9活性检测结果显示:CSE刺激后,细胞内Caspase 9活性显著上升(P﹤0.05)。Western blotting检测结果显示,CSE处理后细胞Caspase 9、Caspase 3和P53的蛋白水平明显升高(P﹤0.05),同时CSE可提高Bax的蛋白水平,而减低Bcl 2的蛋白水平。SFN和NAC处理后则出现相反的结果。7.细胞衰老相关因子检测:经SA-β-半乳糖苷酶染色后实验结果显示:CSE并不能引起RLE-6TN细胞SA-β-半乳糖苷酶活性的改变。8.程序性坏死相关因子的检测:Western blotting检测结果显示,CSE处理后,p-MLKL的蛋白表达水平没有发生变化。研究结论:CSE可致RLE-6TN细胞线粒体结构和功能损伤,并诱导线粒体自噬;线粒体自噬水平增高可能促使RLE-6TN细胞通过线粒体途径发生凋亡。