论文部分内容阅读
三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是我国重要的淡水育珠蚌,我国淡水珍珠大部分由其培育,具有重要的经济价值。同时其培育出的珍珠质量与性别有关,雄蚌所育珍珠质量更优,三角帆蚌属于雌雄异体,没有异型性染色体,性别决定机制的解析一直没有重大突破。本实验从三角帆蚌性腺转录组库中挑选出三个基因的片段,分别是:KLHL10,IRE1A和SF1基因,通过RACE（Rapid-amplification of c DNA ends）法克隆了它们的c DNA全长序列,分析它们的序列结构特点,通过实时荧光定量对其在三角帆蚌不同组织及不同时期的表达量进行定量分析,通过原位杂交对其表达进行定位,并通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）对其功能进行初步探索。1.三角帆蚌KLHL10基因分子分析及功能研究三角帆蚌KLHL10基因的c DNA序列全长2361bp,5’端非编码区（5’UTR）93bp,3’端非编码区（3’UTR）447bp,开放阅读框（ORF区）1821bp,编码606个氨基酸,没有信号肽和跨膜结构。KLHL10基因属于KLHL家族,具有其家族特有的结构域,即1个BTB/POZ结构域、1个BACK结构域和6个kelch重复序列。其氨基酸序列与其它物种的同源性较高,进化树分析显示与其它物种（尤其是软体动物）亲缘关系较近,表明其在进化中保守性较高。KLHL10基因在三角帆蚌6个组织中（斧足、鳃、外套膜、性腺、闭壳肌、肝）均有表达,在性腺组织中的表达具有性别二态性,其中在精巢中的表达量最高,并显著高于雌雄三角帆蚌的其它组织（P＜0.01）,另外雄性外套膜、斧足和肝组织中的表达量也显著高于雌性组织（P＜0.05）;早期表达结果显示,KLHL10基因在六月龄时期表达量最高;原位杂交结果显示其在原始生殖细胞、精原细胞和精母细胞、卵母细胞核仁中均有表达。1龄三角帆蚌正处于生长期,KLHL10基因在1龄精巢组织中特异性表达,根据KLHL10基因的ORF区设计并合成3条ds RNA,对1龄三角帆蚌进行干扰,7天后取样,结果三条干扰链对雌雄均有一定的干扰率。第三条干扰链对雌雄三角帆蚌的干扰率均在80%以上,筛选此组样本分析其它性别相关基因的表达量变化,其中雄性相关基因IRE1A、kx-3基因在KLHL10基因被干扰后具有不同的变化趋势;而雌性相关基因SF1、foxl2、β-catain基因在KLHL10基因被干扰后变化趋势一致,在雄性组织中表达量均是上升。综上,推测在三角帆蚌中KLHL10基因可能参与三角帆蚌性别分化和雄性生殖细胞及精巢发育,另外,KLHL10基因与kx-3基因具有拮抗作用,在精巢中,其可能抑制雌性相关基因的表达。2.三角帆蚌IRE1A基因c DNA序列克隆及表达分析三角帆蚌IRE1A基因全称为丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶/核糖核酸内切酶,其c DNA序列长1675bp,5’UTR长273bp,3’UTR长452bp,ORF区占948bp,共编码了315个氨基酸,不具有信号肽,是胞外蛋白。含有一个S＿TKs结构域和一个Ribonuc＿2-5A结构域,与智人、小鼠等物种的同源性较低,亲缘关系较远,而在软体动物中保守性相对较高。IRE1A基因在斧足、鳃、外套膜、性腺、闭壳肌、肝组织中均有表达,其表达最高的组织是精巢,此外,IRE1A基因在雄性组织中的表达量不同程度的高于雌性组织;在三角帆蚌早期性腺组织中,IRE1A基因在六月龄的表达量高于其它月龄;在1-3龄三角帆蚌性腺组织中,IRE1A基因在精巢中的表达量均显著高于卵巢,且随着蚌龄的增加,IRE1A基因的表达量逐渐升高;原位杂交结果显示:卵巢中IRE1A基因在卵膜和卵原细胞处表达,在精巢中未检测到明显的表达信号,但是由于光学显微镜观察范围有限,推测其在精细胞或精子中表达。由上推测IRE1A基因是雄性相关基因,且对性别分化和精巢发育维持具有一定作用。3.三角帆蚌SF1基因c DNA序列克隆及表达分析三角帆蚌SF1基因为剪接因子1,其c DNA序列全长3244bp,其中5’UTR有129bp,3’UTR有1111bp,ORF区占2004bp,共编码了667个氨基酸,它的蛋白质没有信号肽和跨膜结构。SF1蛋白具有两个结构域和一个锌指结构,分别是:SF1-HH和KH结构域,Zn F-C2HC结构。其氨基酸序列保守性很高,且与软体动物、哺乳动物的亲缘性都很近。SF1基因在斧足、鳃、外套膜、性腺、闭壳肌、肝中均有表达,其在雄性三角帆蚌的鳃中表达量最高;在性腺组织中,雌性表达量显著高于雄性（P＜0.05）;另外,在不同年龄的三角帆蚌中,卵巢中的表达情况均是不同程度的高于精巢;早期定量分析,发现SF1基因在六月龄时期表达量最高;在1-3龄三角帆蚌性腺组织中,SF1基因在卵巢中的表达量不同程度高于精巢,且随着蚌龄的增加,SF1基因在卵巢中的表达量逐渐降低,3龄时,SF1基因在精巢和卵巢中的表达量没有差异;原位杂交在精巢和卵巢中都检测到明显杂交信号,卵巢中,SF1基因在卵细胞膜、卵膜和滤泡处表,精巢中,SF1基因在精原细胞、精母细胞中表达,也可能在精细胞或精子中表达;由上推测SF1基因参与三角帆蚌性别分化和性腺发育。