论文部分内容阅读
目的在前期研究基础上,从网络药理学、体内和体外实验三方面研究黄芪-败酱草药对修复溃疡性结肠炎（UC）肠黏膜屏障功能的作用机制,以期研发有效药物靶向治疗UC。方法1.网络药理学研究首先检索中药系统药理学分析平台（TCMSP）得到黄芪-败酱草药对的有效成分及相关靶点,再使用Gene Cards数据库、OMIM数据库得到溃疡性结肠炎的靶点。将两者靶点进行映射,绘制韦恩图,得到交集靶点,作为黄芪-败酱草药对治疗UC的潜在作用靶点。将交集靶点上传至STRING v11.0数据库,构建蛋白质相互作用（PPI）网络图。利用Metascape数据库对交集靶点进行基因生物过程（GO）富集分析与信号通路（KEGG）富集分析,运行Autodock vina 1.1.2进行分子对接,通过以上方法筛选黄芪-败酱草药对治疗UC的的信号通路及可能靶点。2.体内实验研究60只C57BL/6雄性小鼠随机分为6组,自由饮用2.5%DSS溶液7日构建UC小鼠模型,并于饮用DSS溶液第3天开始进行药物灌胃,给药8天后处死小鼠并观察评估小鼠体重、疾病活动指数、结肠长度及脾指数变化;HE、PAS染色评价结肠组织病理损伤变化;ELISA、q RT-PCR法检测炎症因子IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-13含量;q RT-PCR、WB法检测结肠组织Occludin、Claudin-1 m RNA、蛋白表达变化,q RT-PCR、WB法、免疫组化检测结肠组织JAK1/STAT6/SOCS1通路相关m RNA和蛋白表达;对Occludin和Claudin-1基因表达量逐一与JAK1、STAT6、SOCS1的基因表达量进行相关性分析,探讨黄芪-败酱草药对修复UC小鼠肠黏膜屏障功能的作用机制。3.体外实验研究结合前期研究,LPS 20ug/ml干预HT-29细胞24h后,诱导建立炎症细胞模型,不同浓度黄芪-败酱草药对干预炎症细胞模型24h后,CCK-8法检测细胞活力,筛选黄芪-败酱草药对最佳干预浓度;将最佳干预浓度分为低、中、高剂量组,分别干预LPS诱导的HT-29细胞24h后,ELISA、q RT-PCR法检测炎性因子IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α、IL-13表达;WB法检测Occludin、Claudin-1蛋白表达,采用q RT-PCR、WB法检测JAK1、STAT6、SOCS1 m RNA及蛋白表达;观察黄芪-败酱草药对对LPS诱导的HT-29炎症细胞模型的保护作用,并深入阐释黄芪-败酱草药对修复UC肠黏膜屏障功能的作用机制。结果1.网络药理学结果通过数据库筛选得到黄芪-败酱草药对中的槲皮素、木犀草素、山奈酚为网络中的关键成分,AKT1、TP53、VEGFA等是其治疗溃疡性结肠炎的关键作用靶点,在GO富集分析中涉及对无机物的反应、对脂多糖的反应、凋亡信号通路、细胞对有机环化合物的反应等方面;在KEGG通路富集分析结果包含前期研究中涉及的JAK/STAT信号通路。分子对接结果显示AKT1、CASP3、JUN、IL1B、PTGS2与槲皮素、木犀草素、山奈酚有较好的结合能力,TP53、VEGFA、MYC与槲皮素、木犀草素、山奈酚可以结合。信号通路蛋白JAK1、SOCS1与槲皮素、木犀草素、山奈酚有较好的结合能力,STAT6与槲皮素、木犀草素、山奈酚可以结合。2.体内实验结果体内成功复制UC小鼠模型,黄芪-败酱草药对治疗后可有效减轻DAI评分、体重减轻、结肠缩短、脾脏指数等。此外,它还能显著下调DSS诱导的炎性因子IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α的过度表达（P＜0.05-P＜0.0001）,上调抗炎因子IL-13、Occludin、Claudin-1的表达（P＜0.05-P＜0.0001）,显著降低JAK1和STAT6的m RNA表达（P＜0.05,P＜0.01,P＜0.0001）,下调p-JAK1和p-STAT6蛋白表达（P＜0.05-P＜0.001）,上调SOCS1的m RNA和蛋白表达（P＜0.05-P＜0.0001）,并呈剂量依赖性。结果还发现,Occludin和Claudin-1基因表达量与JAK1、STAT6表达水平呈负相关,Occludin和Claudin-1与SOCS1表达水平呈正相关,Occludin、Claudin-1与JAK1、STAT6、SOCS1的基因表达量具有相关性（P＞0.05）。3.体外实验结果选择黄芪-败酱草药对2.25mg/ml、4.5mg/ml、9mg/ml作为低、中、高干预浓度进行后续实验,不同浓度黄芪-败酱草药对干预后结果显示:中、高剂量组、美沙拉嗪组IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α表达降低,IL-13分泌增多（P＜0.05-P＜0.0001）;高剂量组、美沙拉嗪组Occludin和Claudin-1的蛋白均表达上调（P＜0.01-P＜0.0001）;高剂量组、美沙拉嗪组JAK1、STAT6 m RNA表达均下调,SOCS1m RNA表达上调（P＜0.05-P＜0.0001）,p-JAK1和p-STAT6蛋白表达下调,SOCS1蛋白表达上调（P＜0.05-P＜0.0001）,两者无统计学差异差异（P＞0.05）。结论1.网络药理学KEGG通路富集分析发现,黄芪-败酱草药对主要涉及JAK-STAT通路等信号通路,分子对接结果显示主要成分槲皮素、木犀草素、山奈酚与通路蛋白JAK1、SOCS1、STAT6有较好的结合能力,提示黄芪-败酱草药对可能通过调控JAK1/STAT6/SOCS1通路靶向治疗UC。2.Occludin、Claudin-1与JAK1、STAT6、SOCS1的基因表达量具有相关性,提示通过JAK1/STAT6/SOCS1通路可调控Occludin、Claudin-1表达,这可能是修复UC肠黏膜屏障功能的一个新靶点。3.黄芪-败酱草药对对DSS诱导的UC小鼠模型及LPS诱导的HT-29细胞具有显著保护作用,可能通过JAK1/STAT6/SOCS1通路上调Occludin、Claudin-1、IL-13的表达,下调致炎因子IL-6、IL-1β、IL-18、TNF-α表达,从而修复UC肠黏膜屏障功能发挥保护作用。