【摘 要】
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细菌耐药问题被世界卫生组织评定为一个重大的全球卫生威胁。细菌一般通过染色体突变或者基因水平转移两种方式获取对抗生素的耐药性,其中后者是耐药性传播的主要原因,此过程一般通过转化、结合和转导方式进行,而以噬菌体为主要对象对基因进行转导传播的方式又是细菌基因水平转移的重要方式之一,却总是被忽视。本文通过裂解性噬菌体和溶原性噬菌体两方面对耐药基因水平传播进行评估,在裂解性噬菌体和溶原性噬菌体的基因组上,我
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细菌耐药问题被世界卫生组织评定为一个重大的全球卫生威胁。细菌一般通过染色体突变或者基因水平转移两种方式获取对抗生素的耐药性,其中后者是耐药性传播的主要原因,此过程一般通过转化、结合和转导方式进行,而以噬菌体为主要对象对基因进行转导传播的方式又是细菌基因水平转移的重要方式之一,却总是被忽视。本文通过裂解性噬菌体和溶原性噬菌体两方面对耐药基因水平传播进行评估,在裂解性噬菌体和溶原性噬菌体的基因组上,我们都发现了不可忽视的耐药基因片段,噬菌体在耐药基因水平传播的过程中发挥着重要作用,耐药基因转导传播的方式不容忽视。本文从广东地区某猪场的猪粪便中分离到135株大肠杆菌,作为宿主菌,成功从同一猪场的污水处理池中分离出两株裂解性噬菌体,命名为HZP2和HZ2R8,其宿主分别是HZA135和HZA50。HZP2和HZ2R8均属于短尾噬菌体科,生物学特性稳定,能快速繁殖,裂解量分别为120 pfu/cell和93 pfu/cell。HZP2基因组全长32448bp,GC含量为48.30%,序列号为MK542821;HZ2R8基因组全长39482bp,GC含量为48.61%,序列号为MG832642。HZP2和HZ2R8的全基因组序列结构和组成相似,HZP2注释有43个开放阅读框,HZ2R8注释有38个开放阅读框,主要分为裂解模块、DNA复制与调控模块、包装与结构模块和宿主抑制模块。基于噬菌体末端酶大亚基建立的进化树显示HZP2和HZ2R8进化关系密切,这也是HZP2和HZ2R8分离于同一个猪场污水处理系统的佐证。对宿主菌进行药敏实验,根据药敏实验结果进行耐药基因荧光定量,以MOI为10:1对裂解性噬菌体进行富集,计算裂解性噬菌体转导耐药基因的转导频率TF（耐药基因在裂解性噬菌体内的绝对丰度/pfu）和转导能力TA[单位个体（噬菌体和菌）耐药基因绝对丰度比值与噬菌体裂解量的乘积],进一步评估裂解性噬菌体对耐药基因水平传播情况,结果显示:HZP2对不同耐药基因的TF在4.09E-6～4.36E-3之间;HZ2R8对不同耐药基因的TF在2.49E-6～6.22E-5之间。HZP2对不同耐药基因的TA分别是:sul3（1.80E-2）>tetM（3.21E-3）>mcr-1（2.23E-3）>blaTEM（1.28E-3）>cmlA（9.52E-4）>qnrS（2.28E-4）;HZ2R8对不同耐药基因的TA分别是:mcr-1（8.21E-4）>blaTEM（2.51E-4）>cmlA（2.40E-4）>qnrS（7.96E-5）。同时通过丝裂霉素C诱导溶原性噬菌体,提取溶原性噬菌体基因组,通过PCR验证,评估溶原性噬菌体对耐药基因水平转移情况。首先通过PCR检测12种特定耐药基因,筛选出112株携带三个或者三个以上耐药基因的大肠杆菌。进一步在丝裂霉素C终浓度为1μg/m L,诱导时间为12h的条件下进行诱导试验,共有97株大肠杆菌成功诱导出溶原性噬菌体。PCR结果显示:溶原性噬菌体基因组中检测到mcr-1,blaTEM,erm B,qnrS,flo R,aac-（6′）-lb-cr,tetM和sul18种耐药基因,表明这8种耐药基因在大肠杆菌和溶原性噬菌体之间均可能随机发生了水平转移现象。其中qnrS在细菌基因组中检测到63株,而在噬菌体中检测到46株,耐药转导比率高达73.02%,这说明了溶原性噬菌体对qnrS基因的转导能力很强。mcr-1耐药基因在细菌中检测到53株,而在溶原性噬菌体中也检测到了19株,耐药转导比率高达35.85%,溶原性噬菌体对mcr-1基因的转导作用不可忽视。总体来说,本文通过裂解性噬菌体和溶原性噬菌体两方面,一定程度上评估了大肠杆菌噬菌体对不同耐药基因水平传播的影响,同时也为后续研究噬菌体的转导机制,甚至遏制耐药性通过噬菌体转导作用的再传播提供理论基础。
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