【摘 要】
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2013年我国首次出现人感染H7N9亚型禽流感的病例,该病毒在家禽上无任何症状显现,为低致病性（LP）。此后,LP H7N9亚型病毒在全国范围内迅速蔓延,造成了五波疫情的流行。2016年6月,我国首次分离到了新型高致病性（HP）H7N9病毒,其在血凝素（HA）蛋白的裂解位点处具有多个氨基酸（KRTA）的插入。HP H7N9病毒的流行不仅造成家禽大规模死亡,而且导致的人感染病例的激增。据统计,第五波
【基金项目】
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国家自然科学基金（31830097、31672586、U1501212）； 广东省重点领域研发计划项目（2019B020218004）； 广东省自然科学基金项目（2015A030313422）； 国家肉鸡产业技术体系项目（nycytx-42）； 广
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2013年我国首次出现人感染H7N9亚型禽流感的病例,该病毒在家禽上无任何症状显现,为低致病性（LP）。此后,LP H7N9亚型病毒在全国范围内迅速蔓延,造成了五波疫情的流行。2016年6月,我国首次分离到了新型高致病性（HP）H7N9病毒,其在血凝素（HA）蛋白的裂解位点处具有多个氨基酸（KRTA）的插入。HP H7N9病毒的流行不仅造成家禽大规模死亡,而且导致的人感染病例的激增。据统计,第五波H7N9疫情中共报告了764例人类感染病例,超过前四次流行人类病例报告数的总和。HP H7N9 HA蛋白裂解位点具有碱性和非碱性氨基酸的联合插入的特征,同时涉及到邻近区域氨基酸位点的突变。在流行的早期阶段,病毒的HA裂解位点（HACS）主要存在四种基序:PEV.PKRKRTAR/G,PEV.PKGKRTAR/G,PEV.PKGKRIAR/G和PEV.PKRKRAAR/G。其中PEV.PKRKRTAR/G是主要流行的基序,P PEV.PKGKRTAR/G仅在家禽中分离到,后两种基序各仅有1株人类病例毒株。迄今为止,不同的HACS和非碱性氨基酸插入的功能对H7N9病毒的毒力影响尚不清楚。因此,本研究以实验室前期分离到的HP H7N9亚型AIV（A/chicken/HZ-3/2016）的HA基因为模板,通过定点突变赋予其不同的HA裂解位点基序,最后利用反向遗传学构建出6株仅HA裂解位点区域不同的H7N9重组病毒。然后我们通过评估6株重组病毒在细胞中的切割效率、复制能力、稳定性以及在SPF鸡中的致病性和传播性来表征病毒。研究表明高致病性H7N9病毒通过增强的复制能力和HA切割效率,以及提高的稳定性来增强毒力。H7-VPKRKRTAR病毒在非碱性氨基酸TA插入后病毒的热稳定性显著提升,338位点由甘氨酸（G）突变为精氨酸（R）后病毒HA蛋白的裂解水平显著提高。同时,H7-VPKRKRTAR在SPF鸡体内病毒滴度稍低于其他高致病性毒株,即缓慢致死的情况下高效传播。这种综合的特性有利于PEV.PKRKRTAR/G基序在病毒中的流行。H7-VPKGKRIAR病毒在禽类细胞中的复制水平较低,且在24小时达到复制峰值后逐渐降低;体内实验结果表明SPF鸡同居组有50%的存活率,并且出现感染后不完全死亡的情况,显示出该病毒较弱的直接接触传播能力和毒力。携带PEV.PKGKRIAR/G基序的病毒不能较好的适应禽类细胞和SPF鸡,证明H7N9亚型HACS插入的不同非碱性氨基酸影响病毒对不同宿主种类的适应性。低致病性H7N9病毒中335位点缬氨酸的存在增强了病毒的耐酸性,提高了在细胞中的复制水平及其在SPF鸡中的传播效率。结果表明低致病性HP H7N9的进化涉及HA裂解位点邻近区域的适应。研究结果阐明了HA蛋白裂解位点独特基序对H7N9病毒毒力的影响,并且明确了碱性氨基酸与非碱性氨基酸的重要作用。因此,应加强对H7N9亚型禽流感病毒的监测风险评估,并及时评估新出现病毒的生物学特性。
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