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海洋球石藻(Emiliania huxleyi,Ehux)宿主-病毒(EhV)的互作过程是影响海洋碳、硫生物地化循环及全球气候变化的重要环节。病毒与宿主间侵染和抵抗的博弈,实质上是一场生物化学代谢的军备竞赛。作为大的双链DNA病毒,该病毒进化出一种全新的“病毒细胞代谢”模式,重编程宿主代谢途径以满足其更高的代谢需求,但对这一代谢模式的调控机制尚缺乏足够的认识。MicroRNAs(miRNAs)与其作用的靶基因是响应环境胁迫的重要调控因子。目前,对miRNA与浮游植物代谢调控之间的关联了解很少。本论文以Ehux-BOF92-Eh V99B1宿主-病毒互作模式系统为研究对象,聚焦“miRNA在球石藻病毒重塑宿主脂代谢网络中的分子功能”这一科学问题,整合表观组、转录组和脂质代谢组等多组学关联技术,解析病毒介导的关键脂代谢途径,确定病毒诱导的关键miRNA及其靶向调控的脂代谢信号通路,实验验证miRNA与靶基因之间的作用方式。主要研究结果如下:(1)病毒介导的脂代谢相关转录组重构:基于病毒感染的m RNA转录组数据分析显示,病毒感染诱导的差异表达m RNAs显著富集于脂肪酸、类固醇生物合成、光合作用、氨基酸以及碳水化合物等代谢过程;以脂代谢为核心的代谢通路显示,参与甘油脂、脂肪酸和鞘脂等代谢途径中的关键酶基因表达水平均发生显著变化,如鞘脂代谢过程中催化神经酰胺水解的碱性神经酰胺酶(ACER)基因显著上调,而催化神经酰胺糖基化形成鞘糖脂(GSLs)的葡糖神经酰胺合成酶(UGCG)基因则显著下调,从而加速神经酰胺——这一鞘脂代谢中间产物的快速分解以抑制宿主细胞过早启动细胞凋亡程序;同时催化鞘糖脂水解的葡糖脑苷脂酶(GBA)基因显著上调,而下调的UGCG与上调的GBA协同作用抑制了病毒性鞘糖脂(v GSLs)的合成和积累,从而影响病毒的组装与释放。可见,感染过程中病毒-宿主在鞘脂代谢途径中展开了激烈的博弈。此外,病毒感染过程中,参与脂质转运的20个ABC转运蛋白(ABC transporters)基因的表达均具有显著性差异,表明病毒感染也显著干扰了宿主细胞脂质代谢物的转运过程。(2)miRNA靶向调控脂代谢的关键途径:基于实验室前期的miRNA测序结果,本研究对其重新进行鉴定分析,结果共鉴定出24条响应病毒感染表达的miRNAs(来自宿主基因组)和2条t RFs(来自病毒基因组),茎环q RT-PCR验证确定了4条差异表达的miRNAs(ehx-mi R-2,ehx-mi R-5,ehx-mi R-6,ehx-mi R-7)和1条t RF3-Arg TCT,它们差异表达的靶基因主要富集于脂质代谢、ABC转运蛋白、光合作用、碳水化合物以及氨酰基-t RNA生物合成等代谢过程;进一步筛选与miRNAs/t RF表达负相关的靶基因,并结合病毒诱导的差异脂质代谢物组成和水平,构建整合的“miRNA-m RNA-脂质代谢物”代谢通路图,结果显示病毒感染显著重塑了宿主脂代谢,如在鞘脂代谢途径中,ehx-mi R-5和ehx-mi R-6靶向抑制宿主丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)基因的表达,从而导致神经酰胺Cer和Cer G1丰度显著下降;在甘油脂代谢途径中,ehx-mi R-5靶向抑制甘油三酯脂肪酶(TGL)基因,从而导致甘油脂DAG和MAG的含量降低;在脂肪酸降解途径中,ehx-mi R-6和ehx-mi R-7均靶向抑制乙酰辅酶A酰基转移酶(ACAT)基因的表达,导致大多数脂肪酸(FAs:C14-C18)含量增加。另外,ehx-mi R-6、ehx-mi R-7及t RF3-Arg TCT均显著靶向ABC转运蛋白基因,调节各种脂质代谢物在细胞及细胞区室之间的转运。(3)miRNA靶向转录因子相关基因:miRNAs/t RF可以靶向多种不同的转录因子,如转录起始因子TFIID亚基(transcription initiation factor TFIID subunit)、含同源盒结构域转录因子(Transcription factor,contains HOX domain)、C2H2型锌指蛋白转录因子(Zn-finger,C2H2 type)、碱性亮氨酸拉链转录因子(b ZIP transcription factor)、MYB转录因子(Transcription factor,Myb superfamily)以及热休克转录因子(Heat shock transcription factor)等。这些转录因子相关基因的表达丰度在病毒感染过程中也发生了显著变化,表明病毒感染诱导的miRNAs/t RF也可能通过靶向转录因子调节宿主脂代谢过程。(4)t RF3-Arg TCT与光系统II放氧增强蛋白1(PSBO-1)基因靶向关系验证:测序证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告载体psi CHECK-2-wt和psi CHECK-2-mut;与共转染psi CHECK-2-wt和miRNA阴性对照模拟物(mimics NC)的Hep G2细胞中荧光素酶活性(0.69±0.02)相比,共转染psi CHECK-2-wt和t RF3-Arg TCT的细胞中荧光素酶活性(0.84±0.02)明显升高(p<0.01),表明t RF3-Arg TCT与PSBO-1之间存在靶向关系。