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目的: 制备粒细胞样髓源性抑制细胞(granulocytic myeloid-derived suppressor cells,G-MDSC)来源的exosomes(G-MDSC exo),研究G-MDSC exo的免疫抑制功能;观察G-MDSC exo在葡聚糖硫酸钠盐(dextran sulfact sodium,DSS)诱导的小鼠炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)中的作用及其机制。 方法: (1)G-MDSC exo制备及鉴定 构建荷瘤小鼠模型,磁珠分选G-MDSC并体外培养,收集培养上清,联合超速离心技术,膜超滤技术以及相关试剂制备G-MDSC exo。通过透射电子显微镜观察G-MDSCexo的形态和大小,通过Western blot对G-MDSC exo表面分子CD63进行检测,通过比色法检测精氨酸酶1(arginase1,Arg-1)活性。 (2)G-MDSC exo的免疫抑制功能检测 磁珠分离小鼠脾脏CD4+T细胞,抗CD3/CD28抗体刺激其增殖,并在体系中加入不同剂量的G-MDSC exo,以中性粒细胞来源的exosomes(neutrophil derived exosomes,Neu exo)作阴性对照组,通过3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-thymidine,3H-TdR)掺入法检测各组CD4+T细胞增殖情况。利用鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)构建小鼠迟发型超敏反应(delayed type hypersersitivity, DTH)模型,在初次免疫后的第2天、第4天及第6天分别通过小鼠腹腔注射30μg G-MDSC exo,并以Neu exo作阴性对照,在第7天进行激发试验,记录激发后的24h、36h及72h小鼠足垫厚度,计算各时间点小鼠足垫肿胀情况。通过Arg-1抑制剂nor-NOHA(Nω-hydroxy-nor-Arginine,NN)阻断G-MDSC exo中Arg-1活性后,再次利用T细胞增殖试验和DTH小鼠模型观察Arg-1在G-MDSC exo免疫抑制功能中的作用。 (3)G-MDSC exo促进调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)扩增磁珠分离小鼠脾脏CD4+T细胞,在抗CD3/CD28抗体活化下,用TGF-β诱导其向Treg细胞分化,在培养体系中加入不同剂量的G-MDSC exo或者Neu exo,培养72h后通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的比例。 (4)G-MDSC exo抑制小鼠IBD的发展 通过自由饮用2.5% DSS的方式诱导小鼠IBD,在饮水的第2天、第4天和第6天分别给小鼠腹腔注射30μg的G-MDSC exo,并以Neu exo作为阴性对照组。在实验过程中,每天记录小鼠的体重变化、粪便性状及便血情况,计算各种小鼠不同时间的疾病活动指数(disease activity index,DAI);在饮用DSS的第8天,处死小鼠,分离结肠组织,观察结肠标本外观并测量长度,苏木伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色观察炎症浸润情况并进行组织病理学评分。 通过流式细胞术分析小鼠肠系膜淋巴结中辅助T细胞1型(helper T cell type1,Th1)和Treg细胞在CD4+T细胞中的比例,通过酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbent assay,ELISA)检测血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)水平。 结果: (1)从G-MDSC培养上清中分离出G-MDSC exo;鉴定试验结果显示:G-MDSC exo为圆形或椭圆形的微囊状结构,粒径多为30-100nm,表达CD63分子,不表达钙联接蛋白(Calnexin),其裂解液中能检测到Arg-1活性。 (2)在体外,CD4+T细胞增殖体系中,60、90μg/ml G-MDSC exo处理组的每分钟脉冲数(counts per minute,CPM)低于空白对照组和Neu exo处理组(P<0.01或P<0.05),而30μg/ml G-MDSC exo组没有明显变化(P>0.05)。在Arg-1阻断实验中,60、90μg/ml(G-MDSC+NN) exo处理组的CPM均低于G-MDSC exo处理组(P<0.05)。结果表明在体外G-MDSC exo可有效抑制CD4+T细胞增殖,IFN-γ分泌,并且这种抑制效应与G-MDSC exo中Arg-1分子有关。 在小鼠DTH实验中,激发后24h、48h和72h,G-MDSC exo处理组小鼠的足垫肿胀程度明显低于Neu exo或(G-MDSC+NN) exo处理组(P<0.01或P<0.05),表明G-MDSC exo可有效减轻小鼠DTH反应。 (3)60μg/ml或90μg/ml G-MDSC exo处理组Treg细胞比例明显高于空白对照组(P<0.01或P<0.05),而30μg/ml G-MDSC exo处理组无明显增加(P>0.05),并且G-MDSC exo呈剂量依赖性地增加诱导体系中Treg细胞的百分比。 (4)造模第6、7天,较Neu exo或(G-MDSC+NN)exo处理组,G-MDSC exo处理组小鼠DAI均下降(P<0.05);造模第8、9及10天,较Neu exo处理组,G-MDSCexo处理组小鼠DAI均显著减少(P<0.01),较(G-MDSC+NN) exo处理组,G-MDSCexo处理组小鼠DAI均减少(P<0.05)。 造模第8天,较Neu exo处理组,G-MDSC exo处理组小鼠结肠充血肿胀程度,结肠缩短程度,炎症细胞浸润程度及病理评分均减轻或明显减轻(P<0.05或P<0.01),而(G-MDSC+NN) exo处理组较G-MDSC exo处理组上述各指标均增加均增加(P<0.05)。表明G-MDSC exo能有效改善小鼠IBD,并且与Arg-1有关系。 造模第8天,较Neu exo处理组,G-MDSC exo处理组小鼠肠系膜淋巴结中Th1细胞比例减少(P<0.05),Treg细胞比例增多(P<0.05),血清TNF-α和IFN-γ水平下降(P<0.05);较G-MDSC exo处理组,(G-MDSC+NN) exo处理组小鼠肠系膜淋巴结中Th1细胞比例增加(P<0.05),Treg细胞比例无明显变化(P>0.05),血清TNF-α和IFN-γ水平下降(P<0.05)。表明G-MDSC exo通过抑制Th1介导炎症反应及促进Treg细胞从而有效抑制小鼠IBD,并且这种抑制作用与Arg-1有关。 结论: (1)成功制备G-MDSC exo;证明G-MDSC exo能抑制CD4+T细胞增殖和DTH反应,并且一定程度上依赖于Arg-1;并且G-MDSC exo能有效增加体外诱导体系中Treg细胞的比例。 (2)G-MDSC exo可有效减轻小鼠IBD的疾病程度,这与其抑制Th1细胞增殖及促进Treg细胞扩增有关。