论文部分内容阅读
目的:胃癌是一种常见的高发恶性肿瘤,由于缺乏精准的早期诊断方法,致使大多数患者被确诊时已是肿瘤晚期,胃癌已成为致死率居于世界第三的癌症。近年来,液体活检技术得到了迅速发展,循环RNA作为疾病标志物分子的价值得到了认可,特别是不同类型的RNA分子以及m6A甲基化修饰的改变将逐渐成为了肿瘤标志物候选靶标分子。本研究一方面将在已有的研究基础上继续对胃癌血浆中的RNA分子进行筛选鉴定,以期获得胃癌血浆RNA分子标志物,并探讨其作为胃癌诊断标志物的可行性。另一方面,本研究构建了m6A修饰RNA结合蛋白YTHDF2重组表达载体并诱导表达,为m6A修饰RNA的生物学功能研究和建立肿瘤标志物筛选鉴定方法提供基础。方法:1)采用RT-qPCR方法对候选的6条胃癌血浆差异表达的RNA分子在训练组77例正常对照和81例GC患者血浆中进行验证,并进行统计血分析。2)挑取在训练组中显著差异化表达的RNA,利用RT-qPCR方法进一步在验证组34例正常对照和36例GC患者血浆中进行重复验证,进行ROC曲线分析并计算AUC值、灵敏度及特异性值。3)分析筛选得到的RNA分子表达水平与患者临床病理学数据之间的相关性关系,评估其作为候选生物标志物在GC患者中的诊断价值。4)以mRNA为模板采用RT-PCR方法扩增YTHDF2基因编码区序列,构建pET-28a-YTHDF2重组表达质粒。5)在大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中诱导表达YTHDF2融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和胶纯化。6)利用Ni2+-NTA磁球分析融合蛋白活性。结果:1)经验证6条差异化表达的RNA,其中4条mRNA RGS18（P<0.0001）,ITM2B（P=0.0078）,PPBP（P<0.0001）和NAP1L1（P=0.0237）在GC患者血浆中低表达,2条ncRNAn324674（P=0.0069）,ENST00000442382（P=0.3994）在GC患者中高表达。验证组中RGS18（P<0.0001）,PPBP（P=0.0012）;训练组中ROC曲线分析RGS18、ITM2、PPBP、NAP1L1、n324674,和ENST00000442382的AUC值分别为0.735、0.635、0.721、0.629、0.639和0.597。验证组中ROC曲线分析RGS18、PPBP的AUC值分别为0.811和0.710。结合患者临床病理学资料,GC患者与正常对照之间PPBP的差异表达在女性中更为显著。2)成功构建了pET-28a-YTHDF2重组表达载体,纯化获得了YTHDF2融合蛋白,该融合蛋白具有结合m6A修饰RNA活性。结论:1)在胃癌患者血浆中RGS18、ITM2、PPBP、NAP1L1表达水平与正常对照存在显著差异,上述候选胃癌血浆标志物分子具有进一步深入研究价值,有望成为胃癌血浆标志物分子。2)重组YTHDF2融合蛋白的获得为研究m6A修饰RNA的生物学功能提供了重要工具分子。