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大部分细菌和几乎所有古生菌的基因组中,都存在着一种规律排列成簇的短回文重复序列CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats),由 spacer和repeat间隔排列组成。这种重复序列的相邻位置往往是一些CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins)Cas的编码基因,这类蛋白具有核糖核酸内切酶的功能,与CRISPR转录出的导向性RNA共同形成这些微生物中的一种适应性免疫系统,即CRISPR-Cas系统,用于抵御外来病毒和噬菌体的入侵。基于该系统的特性,人们发展了一系列高效的基因编辑工具,在植物、动物、微生物中均得到广泛应用。Cas12a(又称Cpf1)属于Cas蛋白家族的ClassII typeV型蛋白,含有Ruvc结构域和Nuc结构域,同时具备DNA核酸酶活性和RNA核酸酶活性。与常用的Cas9不同的是,Cas12a不仅可以对靶标DNA进行切割,也可以对自身CRISPR转录的RNA前体进行切割加工,形成成熟的crRNA(CRISPRRNA)。而且Cas12a蛋白的分子量比Cas9蛋白小100个氨基酸,适配的PAM(protospacer adjacent motif)序列为5’-TTN-3’,而不是5’-NGG-3’,更适用于GC含量更低的物种,针对AT含量丰富的基因序列可选择的靶标位点更多,更具优势。扬氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)是食气梭菌的代表性菌株之一,具有Wood-Ljungdahl固碳途径,能够以CO、CO2气体为唯一碳源进行生长,并代谢产生有机酸和有机醇等,具有良好的工业应用前景。然而,扬氏梭菌作为一种低GC含量的革兰氏阳性菌,全基因组内的GC含量大约只有31%,可供CRISPR-Cas9系统识别的PAM序列较少,尤其是对于基因组上一些短小的序列而言,由于缺乏合适的PAM位点,研究者无法采用CRISPR-Cas9对其进行分子操作。而Cas12a蛋白识别的PAM是序列富含胸腺嘧啶的5’-TTN-3’,在扬氏梭菌基因组上出现的几率极高。因此,开发基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑工具对于扬氏梭菌十分重要,可有效提高编辑效率和灵活性,弥补原有CRISPR-Cas9系统的缺陷和不足。本研究旨在扬氏梭菌中开发基于CRISPR-Cas12a的基因组编辑工具,用于实现基因敲除和基因表达抑制两个方面的目标。在这项研究中,我们首先从四种不同来源的Cas12a蛋白中筛选出针对扬氏梭菌毒性相对较小的蛋白——新凶手土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis subsp.novicida U112)FnCas12a蛋白,并通过体内实验验证了FnCas12a具有体内切割DNA双链的活性,适合在该菌中进行基因编辑工具的开发。因此,针对CRISPR-FnCas12a,构建了基因敲除系统的质粒,并基于改进的高效感受态制备方法,通过该敲除系统成功进行了pta(CLJU_c12770编码磷酸乙酰转移酶的基因)、adhE1(CLJU_c16510编码醇醛脱氢酶的基因)、ctf(CLJU_c39430编码酰基辅酶A转移酶的基因)、pyrE(CLJU_c35680编码乳清酸磷酸核糖转移酶的基因)四个基因的同框缺失。此外,还对FnCas12a蛋白的1006位氨基酸进行了替换,获得失去DNA切割功能的ddFnCas12a(Dead-DNaseFnCas12a)蛋白,开发了该蛋白介导的CRISPRi系统,有效地实现了目标基因的转录下调。具体使果糖培养条件下转录量靠前的四个基因CLJU_c09110(编码厌氧一氧化碳脱氢酶催化亚基的基因),CLJU_c04990(编码表层蛋白质的基因),CLJU_c37650(编码甲酸—四氢叶酸连接酶的基因)以及CLJU_c16510(编码双功能醛/醇脱氢酶的基因)分别产生99%、96%、88%、97%的下调。此外,通过这种基因抑制的方法,在整合了丁酸途径的工程菌株中抑制途径基因adhE1的表达,实现了碳流量的重新分布,根据总溶剂占比情况,乙醇、乙酸和丁酸的分布均有改变,乙醇比率从4.6%(对照)降至2.6%,丁酸比例从26.8%(对照)增加到32.1%,丁酸的产量在一定程度上得以提高,相比于对照组有20%的提升。综上,本研究在扬氏梭菌中建立了高效的遗传操作系统CRISPR-FnCas12a和CRISPR-ddFnCas12a,并将之应用于代谢途径中关键基因的敲除和干扰,为这一重要工业微生物的基础和应用研究提供了技术支撑。