柑桔衰退病毒血清学及分子生物学特性研究

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柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)严重影响柑桔生长,普遍存在于各个柑桔种植区。已有研究表明,柑桔衰退病毒基因组存在较大变异,在田间还存在多个分离物混合侵染的现象,导致其致病力、症状等发生变化,随着柑桔种植结构的调整,新品种的涌现,柑桔衰退病的危害有加重的趋势。本研究从血清学、生物学、分子生物学三方面对我国部分柑桔产区的样品携带CTV的情况进行了分析,得到如下结果:采用DAS-I-ELISA方法和实验室已有10株CTV单克隆抗体,对湖北、江西等地的111个样品进行检测,结果显示,湖北、江西等柑桔产区的CTV携带率高达60%,CTV的分布广泛。不同的样品中的CTV,采用同一单克隆抗体检测时,检测值是不同的。同时,同一种样品中的CTV,检测为阳性的单克隆抗体也不同。依据10株单抗检测同一样品中CTV时,检测为阴性的单抗数量可以将30个样品分为10大类。从检测的CTV阳性样品中,选取N3、20、Y42等30个在血清学上有明显差异的样品,嫁接到酸橙、甜橙、墨西哥莱檬和葡萄柚四种指示植物上。3个月后,在指示植物或接穗上可见CTV所致的典型症状。在墨西哥莱檬和甜橙上,出现茎陷点、叶片褪绿症状。在酸橙上表现严重的衰退症状,新梢老化活黄化,叶片扭曲。酸橙砧甜橙则在嫁接CTV阳性样品后,接穗抽发的嫩梢枯死,果实畸形,叶片脱落。对选取的30个CTV阳性样品,采用CTV CP基因的特异引物,进行RT-PCR检测,均能扩增出672bp CP基因目标带,进一步证明30个样品均携带CTV。采用CTV强毒分离物和弱毒分离物特异引物RT-PCR扩增显示,样品N3、N4中的CTV能扩增出392bp条带,表明两样品可能存在CTV弱毒分离物;样品Y11、Y23、Y32等28个样品可扩增出320bp条带,为强毒分离物,无CTV强毒分离物和弱毒分离物同时存在的样品。30个样品中的CTV CP基因的RT-PCR产物经HinfⅠ/RFLP分析表明,依据Gillings等(1993)的报道,N3和N4为种群Ⅳ,N25为种群Ⅵ,N21则不能归类,本研究定为种群Ⅷ。N25、N3、N4、N21四个样品为CTV单一种群侵染,N3、N4中CTV CP基因酶切的带型一致,为同一种群。N25、N3、N4、N21四个单一侵染的样品中的CTV分离物分别命名为:CTV-N25、CTV-N3、CTV-N4、CTV-N21,对其CP基因进行克隆及序列分析。CTV-N3、CTV-N4与弱毒分离物T30 CP基因核苷酸序列和氨基酸序列相似性均高达99%,CP氨基酸序列在123-125位分别为:IVY,与Pappu等(1993)报道的弱毒分离物CP氨基酸序列特征性位点一致,CTV-N3、CTV-N4为弱毒分离物。CTV-N21与T318A(强毒分离物)CP基因核苷酸序列相似性为95.8%,与SY568(强毒分离物)CP氨基酸序列相似性高达96.4%。CTV-N25与severe mexico(强毒分离物)CP基因核苷酸序列相似性为92.3%,与SY568 CP氨基酸序列相似性为97.3%。与Pappu等(1993)报道的强毒分离物CP氨基酸序列特征性位点一致,CTV-N21与CTV-N25的CP氨基酸序列在123-125位分别为:VVF,CTV-N21与CTV-N25为强毒分离物。CTV强弱毒分离物在序列上存在一致变异,CP基因的多数碱基位点发生了替换,仅3处发生T→A的颠换。本研究CTV分离物CP基因Genbank登录号:CTV-N3(EF517334)、CTV-N4(EF517335)、CTV-N21 (EF063109)、CTV-N25(EF5173366)。
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