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背景和目的牙周炎是发生在牙周组织的感染性疾病,菌斑微生物为牙周炎发生的始动因素,宿主免疫反应为牙周组织破坏的主要因素。巨噬细胞可以分化为促炎状态的M1型和抗炎状态的M2型,当巨噬细胞被募集到牙周组织中时,其分化状态受环境刺激的影响,在细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和/或干扰素-γ(interferon,IFN-γ)诱导下,巨噬细胞分化为促炎状态的M1型,促进宿主炎性反应以抵抗细菌和病毒,并分泌促炎因子,最终导致牙周组织破坏;相反,IL-4和/或IL-13诱导巨噬细胞分化为抗炎状态的M2型,发挥抗炎和促进组织愈合的功能,并分泌抗炎因子,促进组织的修复愈合。多项研究证实,颗粒蛋白酶前体(progranulin,PGRN)为TNF受体竞争性拮抗剂,在免疫调节和抗炎中发挥重要作用。我们先前研究证实发现牙周炎患者龈沟液中PGRN较正常龈沟液含量升高;体外实验证实PGRN促进牙周膜干细胞的成骨分化;重组PGRN可减轻大鼠实验性牙周炎炎症反应及牙槽骨吸收,促进牙周骨缺损的再生。但其在巨噬细胞极化过程中的调控作用及其机制尚不清楚。本研究旨在探讨PGRN在巨噬细胞M1向极化中的作用及其机制。材料与方法1、P.g-LPS对巨噬细胞M1向极化的影响设置分组:RAW264.7细胞在含或不含P.g-LPS(100 ng/ml)的条件下培养24 h后,采用流式细胞术检测M1型表面标记物CD86表达;采用qRT-PCR技术和Western Blot技术检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、一氧化氮合酶(iNOS)的表达;采用ELISA技术检测TNF-α的分泌。2、PGRN对LPS诱导的巨噬细胞M1向极化的影响首先将RAW264.7细胞分为1)空白对照组2)P.g-LPS(100 ng/ml)组;3)100 ng/ml P.g-LPS+不同浓度(5,10,20,40 和 80 ng/ml)的 rPGRN组。刺激 24 h后,采用流式细胞术检测M1/M2表面标记物(CD86/CD206)的比值;采用qRT-PCR技术和Western Blot技术检测TNF-α和iNOS的表达;采用ELISA技术检测TNF-α的分泌。然后将THP-1和骨髓来源单核细胞(BMDMs)分为1)空白对照组;2)P.g-LPS(100 ng/ml)组;3)P.g-LPS(100 ng/ml)+rPGRN(10 ng/ml)组。刺激24 h后,采用流式细胞术检测M1表面标记物CD86的表达;采用qRT-PCR技术和Western Blot技术检测TNF-α和iNOS的表达;采用ELISA技术检测TNF-α的分泌。3、PGRN对LPS诱导的巨噬细胞M1向极化影响的机制1)鉴于肿瘤坏死因子(TNF-α)是巨噬细胞M1极化的主要效应分子之一,而PGRN已知的抗炎作用与肿瘤坏死因子受体(TNFRs)有关,故首先评价TNF-α在LPS诱导的巨噬细胞M1向极化中的作用,为推测PGRN的作用机制与TNFRs有关提供参考依据。实验分组:将RAW264.7细胞分为1)空白对照组;2)P.g-LPS(100 ng/ml)组;3)P.g-LPS(100 ng/ml)+anti-TNF-α(1:200)组;4)20 ng/ml rTNF-α 组;5)30 ng/ml rTNF-α 组;6)40 ng/ml rTNF-α 组。刺激 24 h 后,采用流式细胞术检测M1型表面标记物CD86表达;采用qRT-PCR技术和Western Blot技术检测TNF-α和iNOS的表达。2)为了进一步评价PGRN对LPS诱导的巨噬细胞M1向极化的影响的作用机制,将RAW264.7细胞分为:1)空白对照组;2)rPGRN(10 ng/ml)组;3)P.g-LPS(100 ng/ml)组;4)P.g-LPS(100 ng/ml)+rPGRN(10 ng/ml)组。刺激1h后,采用Western Blot技术检测NF-κB和MAPK信号通路相关蛋白(iκκα/β,iκBα,p65,JNK,p38和ERK)磷酸化水平,采用细胞免疫荧光技术检测p65的入核。结果1、P.g-LPS诱导巨噬细胞M1向极化与对照组相比,P.g-LPS组CD86的表达、TNF-α和iNOS基因和蛋白的表达及TNF-α的分泌显著升高。2、PGRN抑制P.g-LPS诱导巨噬细胞M1向极化与对照组相比,P.g-LPS诱导的RAW264.7细胞CD86/CD206比值、TNF-α和iNOS基因和蛋白的表达及TNF-α的分泌显著升高。在此基础上加入5,10,20 ng/ml rPGRN后,CD86/CD206比值、TNF-α和iNOS的基因和蛋白表达和TNF-α的分泌显著降低。与此类似,在THP-1和BMDMs细胞中,10 ng/ml rPGRN可显著抑制P.g-LPS诱导的CD86的表达、TNF-α和iNOS的基因和蛋白的表达和TNF-α的分泌。3、TNF-α诱导RAW264.7细胞炎性因子的表达而抗TNF-α抗体抑制P.g-LPS诱导的炎性因子表达与对照组相比,40 ng/ml rTNF-α诱导的内源性TNF-α和iNOS表达显著升高,但M1型巨噬细胞表面标记物CD86无明显变化;同样的,与P.g-LPS组相比,LPS+anti-TNF-α组内源性TNF-α和iNOS的基因和蛋白表达显著降低,但CD86的表达无明显变化。4、PGRN抑制P.g-LPS诱导的NF-κB和MAPK信号通路的激活与对照组相比,P.g-LPS能够增强NF-κB和MAPK信号通路中的iKKα/β,iκBα,p65,JNK和p38磷酸化,但对ERK无增强作用;10 ng/ml rPGRN能够抑制P.g-LPS诱导的iKKα/β,iκBα,p65,JNK和p38磷酸化及p65核转位。结论PGRN抑制LPS诱导的巨噬细胞M1向表型及功能的变化。其机制与NF-κB和MAPK信号通路的抑制有关,亦可能与自分泌TNF-α相关受体的阻断有关。