论文部分内容阅读
背景:交联透明质酸（Hyaluronic acid,HA）被广泛应用于治疗皱纹和面部容量缺失,除其物理填充作用外,还有刺激皮肤自我更新的生物学效应。HA交联技术的改进,一直是人们研究该种类填充剂的核心和热点,既可延长其临床填充疗效的持续时间,同时对于皮肤的刺激效应更为持久,减少交联剂的使用,从而降低其不良反应发生率。三重交联缓释技术作为一种新的交联专利技术,理论上充分利用超长链、长链和非交联三种不同HA的各自优势,同时三者产生自我缠绕以达到非交联HA的缓慢释放,进而刺激真皮的自我更新,被称之为Tri-Hyal技术。基于该技术合成的交联HA究竟能否刺激真皮自我更新、持久性如何、受何种机制调控,目前均尚未可知,该研究将通过体内、体外试验来评估和探寻以上核心问题。目的:为了评价基于Tri-Hyal技术合成的交联HA--ART FILLER Universal（AF）抗衰老的有效性、持久性并探寻其潜在抗衰老机制,本研究将通过比较AF和传统交联HA在同一小鼠背部皮肤皮下注射后,在不同时间点进行取材活检,观察皮肤年轻化诸多指标的变化,明确缓释Tri-Hyal交联HA对于皮肤年轻化的影响,以及Tri-Hyal技术对于皮肤年轻化疗效的确切性和持久性;同时体外研究二种HA作用的成纤维细胞活性和相关信号通路的变化,初步明确AF调控皮肤年轻化的相关机制。方法:体内实验:1.动物分组:将每只BALB/c小鼠（n=6）背部共计12个皮肤注射点分为3组,Vehicle组（4个）、AF组（4个）和Res组（4个）。AF组用ART FILLER Universal处理,Res组用RestylaneⅡ处理,Vehicle组用PBS处理。2.动物处理:BALB/c小鼠常规饲喂标准饲料,背部皮下多点注射AF、Res和PBS各50μl。每组4点,分别在第0、30、90和180天在相应点位取皮肤组织做活检。3.采用苏木精和伊红染色（hematoxylin-eosin staining,H＆E）来比较不同交联技术的HA产品对皮肤厚度的影响。4.采用弹力纤维染色来比较不同交联技术的HA产品对真皮弹力纤维的影响。5.采用免疫组织化学染色来比较不同交联技术对真皮中血管内皮细胞粘附分子（CD31）的生成、转化生长因子-β（TGF-β）的生成和基质金属蛋白酶9（MMP9）表达的影响。体外实验:1.细胞分3组:AF试验组、Res对照组,Vehicle组。2.细胞处理:将AF和Res平铺到24孔板（HA浓度为5 mg/ml）,后接种成纤维细胞。3.采用CCK-8试剂盒检测原代人皮肤成纤维细胞的活力水平。4.采用细胞衰老β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒检测原代人皮肤成纤维细胞的衰老程度。5.采用Western Blot方法检测原代人皮肤成纤维细胞自噬标记物LC3II/I的比例和P62、CD44以及UPR相关通路蛋白的表达。6.采用GFP-RFP-LC3腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞检测细胞自噬流水平。7.采用流式细胞术检测原代人皮肤成纤维细胞活性氧（ROS）水平。8.采用ER-Hyper腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞,通过共聚焦荧光成像检测原代人皮肤成纤维细胞内质网中的H2O2水平。9.抑制PERK通路,检测细胞的自噬流水平、衰老、ROS水平以及细胞活力水平。结果:体内实验:1.三重交联缓释技术合成的HA注射后在老鼠背部皮肤可持续性地增加皮肤厚度和弹力纤维的形成。H＆E染色和弹力纤维染色结果显示,随着取材时间点的推移,Vehicle对照组的皮肤厚度、弹力纤维含量略微减少,无显著性差异;Res组的皮肤厚度、弹力纤维含量在90天后开始减少;而AF组的皮肤厚度、弹力纤维含量在180天内持续增加。结果表明,三重交联缓释技术合成的HA与普通HA相比,更持久地刺激皮肤厚度增加以及弹力纤维的合成。2.三重交联缓释技术合成的HA注射后在老鼠背部皮肤可提高CD31和TGF-β的表达,降低MMP9的表达。免疫组织化学染色结果显示,随着时间点推移,Vehicle对照组的CD31、TGF-β的含量逐渐降低,而MMP9则渐升高,无显著性差异;Res组的CD31、TGF-β的含量在90天后逐渐减少,MMP9的含量在90天后开始增加;而AF组的CD31、TGF-β的含量在180天内持续增加,MMP9的表达水平在180天内持续下降。CD31表达水平增高表明血管内皮细胞增殖和血管生成的增加,提示皮肤衰老延缓。TGF-β与皮肤老化有着密切的联系,可促进胶原蛋白的合成并抑制MMPs的合成,延缓衰老。MMP9升高可促进细胞质基质中的蛋白质降解,促进皮肤衰老。结果表明,三重交联缓释技术合成的HA与普通HA相比,更持久的延缓皮肤衰老。体外实验:1.三重交联缓释技术合成的HA可延缓体外原代人皮肤成纤维细胞的衰老。通过CCK8试剂盒实验检测细胞活力,结果显示,与Vehicle组相比,Res组和AF组共孵育成纤维细胞的活力明显升高,且AF组较Res组更显著。通过SA-β-Gal染色与活性实验检测细胞的衰老程度,结果显示,与Vehicle组相比,Res组和AF组的衰老细胞数减少,SA-β-Gal活性降低,且AF组较Res组更显著。证明三重交联缓释技术合成的HA在体外可延缓成纤维细胞的衰老。2.三重交联缓释技术合成的HA通过诱导细胞自噬机制,降低成纤维细胞的ROS水平。通过Western Blot技术以及GFP-RFP-LC3双荧光腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞检测成纤维细胞的自噬水平,结果显示,与Vehicle组相比,Res组和AF组处理后的成纤维细胞的LC3II/I的表达显著增加,P62的表达呈显著下降,并且提高了成纤维细胞的自噬通量,且AF相较于Res组更显著。通过流式细胞术检测不同处理组细胞内的ROS水平,结果显示,与Vehicle组相比,Res组和AF组的ROS水平显著下降,且AF组较Res组更显著。表明细胞可通过诱导自噬清除细胞中的ROS,延缓衰老。证明三重交联缓释技术合成的HA通过诱导自噬降低皮肤成纤维细胞中ROS水平,从而有效延缓皮肤衰老。3.三重交联缓释技术合成的HA通过启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response,UPR）,诱导细胞自噬,改善细胞衰老。采用ER-Hyper腺病毒感染原代人皮肤成纤维细胞并与内质网标记探针ER Tracker共定位,检测原代人皮肤成纤维细胞内质网中的H2O2水平,结果显示,与Vehicle组相比,Res组和AF组内质网H2O2水平显著降低,且AF组较Res组更显著。通过Western Blot技术检测不同HA对成纤维细胞UPR通路的影响,结果显示,与Vehicle组相比,Res组和AF组均激活了UPR。采用PERK抑制剂（GSK2606414）抑制UPR中的PERK通路,通过Western Blot技术检测细胞中自噬蛋白的表达、采用GFP-RFP-LC3双荧光腺病毒感染细胞检测细胞的自噬水平、采用SA-β-Gal染色与活性实验检测细胞的衰老程度、采用流式细胞术检测细胞内的ROS水平以及采用CCK8试剂盒检测细胞活力,结果显示,抑制PERK通路后,AF对自噬蛋白LC3、P62的表达水平、成纤维细胞SA-β-Gal染色阳性细胞数、SA-β-Gal活性、ROS水平、细胞活力的改变均部分或完全被阻断,结果表明,UPR的PERK通路参与了HA通过诱导自噬延缓皮肤衰老的过程。结论:三重交联缓释技术合成的HA有效增加了皮肤厚度、弹力纤维含量,刺激微血管的形成,并且起作用可维持长达6个月（时间长于传统HA）。体外研究发现AF可促进真皮成纤维细胞的活力,抑制其衰老发生。机制研究初步发现,AF通过激活UPR的PERK通路来提高细胞自噬水平,从而降低成纤维细胞中总体的ROS水平,促进皮肤再生,延缓衰老。因此,三重交联缓释技术合成的HA更持久地刺激细胞基质成分的产生,通过诱导细胞自噬延缓皮肤成纤维细胞的衰老。