猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性震颤(CT)、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等相关疾病。其主要临床表现为消瘦、生长迟缓、皮肤苍白、精神不佳和腹泻等，目前已成为危害我国养猪业及世界养猪业的重要免疫抑制性疾病之一。目前对于该病的防治主要依靠疫苗，但由于该病毒在细胞上的增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难。因此，研制安全、高效的新型疫苗成为越来越多研究者关注的热点。本实验室刘根梅等将PCV2 ORF2基因和猪γ-IFN基因经15个氨基酸的连接序列(Gly4Ser)3接头连接后转移至腺病毒骨架载体pAdEasy-1，构建出了重组腺病毒rAd-ORF2-γ-IFN(简称rAd-OI)。免疫小鼠后产生了较高水平的抗体。　　本研究对重组腺病毒rAd-OI的免疫效力进行了更深一步的探讨，通过将重组腺病毒在AD-293细胞上的大量增殖，将重组腺病毒rAd-ORF2-γ-IFN进行灭活处理，制备成油包水佐剂灭活疫苗。然后分别采用未灭活的重组腺病毒与灭活重组腺病毒疫苗进行小鼠接种实验，并做猪体免疫保护实验和市售疫苗对比实验等，最后对其免疫效力进行研究与分析，检验重组腺病毒灭活疫苗预防PCV2的临床效果及优势，为研究一种新的预防PCV2的新型疫苗提供实验数据和理论基础，具有重要的创新性和实用价值。主要研究内容如下：　　1、猪圆环病毒2型(PZ)的分离鉴定及序列分析从猪场采集临床表现为PMWS仔猪的腹股沟淋巴结、脾脏等组织，处理后，进行PCR检测，最终分离出了一株PCV2毒株，命名为PCV2(PZ)。测得其TCID50为10-4.87/0.1ml。设计特异性引物，用以扩增PCV2全长基因1767bp，经过纯化、连接T载体、转化DH5α、质粒抽提，然后质粒的PCR鉴定和双酶切鉴定，将检测阳性的菌液送上海英俊生物技术有限公司测序鉴定。PCR检测结果表明PCV2全基因组均得以扩增，PCV2(PZ)全长1767bp，与预期结果相同。PCV2(PZ)与PCV2-GX08142和PCV2-GX同源性最高，分别达99.0％和99.2%，在进化树上亲缘关系最近。　　2、猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立以猪圆环病毒2型核衣壳蛋白ORF2为目的基因，设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因，并克隆到pMD18-T载体，筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化，建立了实时TaqMan荧光定量PCR检测PCV2的方法。试验结果表明，该方法特异性强，对PRV、PRRSV、CSFV等猪常见病原的检测结果均为阴性；与普通PCR方法相比，其敏感性高出100倍，可达100拷贝/μL；对临床样品的检测证明，该方法可有效检测出淋巴结，肺脏等组织中的PCV2病毒。　　3、rAd-ORF2-γ-IFN重组腺病毒灭活疫苗的制备将构建出的重组腺病毒rAd-ORF2-γ-IFN在AD-293细胞上大量增殖扩繁，检测无细菌、支原体等污染后，进行甲醛灭活处理，其中对灭活时间和浓度进行了优化，然后制备成油包水型灭活疫苗，并通过各种标准检验，生产工艺的改进，最后成功制备rAd-ORF2-γ-IFN重组腺病毒灭活疫苗。　　4、rAd-ORF2-γ-IFN重组腺病毒灭活疫苗的免疫效果研究将制备的rAd-ORF2-γ-IFN重组腺病毒灭活疫苗进行了一系列的临床试验。首先进行小鼠免疫试验，检测灭活疫苗在小鼠体内的抗体水平消长规律；最后进行猪的临床试验，通过安全试验，效力试验，疫苗对比试验，保存期试验等监测疫苗的临床效果，并对其免疫效力进行研究与分析。研究表明：小鼠免疫试验和猪的临床试验中，rAd-ORF2-γ-IFN灭活疫苗表现出良好的抗体水平和抗病毒效果，疫苗在动物体内能有效刺激PCV2 gap蛋白抗体的产生，疫苗的效果显著，为研究一种新型疫苗提供重要依据和实验基础，为养猪产业预防圆环病毒提供又一有效产品和途径。