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日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)是一种重要的人畜共患病病原,可引起妊娠母猪的流产、死胎,仔猪的脑炎和种猪的繁殖障碍,同时可经蚊虫传染给人类,引起人的病毒性脑炎,严重威胁着公共卫生安全和养殖业的发展。JEV属于黄病毒科黄病毒属,是单链正股RNA病毒。基因组含有的一个开放阅读框可以编码3个结构蛋白和7个非结构蛋白。其中在NS2a蛋白编码区存在着核糖体移码信号,翻译出的融合蛋白被认为与NS1有关,称作NS1’蛋白。该蛋白存在于病毒复制的早期,参与病毒的组装与释放。本研究以化学合成的ANSI’蛋白免疫小鼠,以基因重组技术获得的重组NS1’蛋白作为筛选蛋白,利用杂交瘤细胞融合技术,成功制备了4株抗NS1’蛋白的单克隆抗体,并鉴定获得了一个线性表位,为JEV临床诊断方法的建立和NS1’蛋白相关功能的深入研究奠定了基础。具体研究内容如下：1.日本脑炎病毒NS1’移码蛋白的原核表达与免疫反应性鉴定采用PCR方法以实验室保存的JEV NJ2008为模板扩增NS1’基因,并将其克隆至pET-32a表达载体中,获得的阳性重组质粒转化到E.coli BL-21感受态细胞中,经IPTG诱导后可实现目的片段的可溶性表达。重组NS1’蛋白的大小约为25KDa,经Western-blotting分析,重组蛋白能够与His-tag单抗反应,也能够被抗JEV NJ2008血清识别,但是不能被抗JEV SA14-14-2血清识别。试验结果表明,JEV-NS1’基因在大肠杆菌原核表达系统中得到了高效表达,且该重组蛋白具有抗原性。2.日本脑炎病毒NS1’移码蛋白单克隆抗体的制备与鉴定以化学合成的ANS1’多肽免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤细胞融合技术,辅以原核表达的NS1’蛋白建立的间接ELISA方法进行筛选,获得了4株稳定分泌抗NS1’单克隆抗体的杂交瘤细胞株：2E10、382、4G9、5E6。间接ELISA测定,其细胞培养液上清效价为1：10240、1：10240、1：5120和1：10240,腹水效价均为1：107。单抗亚型分析结果显示,2E10单抗亚型为IgG2b,3B2、4G9、5E6亚型均为IgG1,所有单抗轻链均为K型。Western-blotting和间接免疫荧光试验鉴定结果显示,四株单克隆抗体具有良好的特异性,均能识别JEV NJ2008株,不识别JEV SA14-14-2株。本研究获得的单克隆抗体,为临床检测乙脑早期感染和病毒抗原表位分析的研究奠定了基础。3.日本脑炎病毒NJ2008株NS1’移码蛋白B细胞表位的初步鉴定以JEV NJ2008株为模板,设计扩增两个截短NS1’基因片段,克隆至pET-32a载体,利用大肠杆菌原核表达系统表达这两个重组截短的蛋白。结合间接ELISA和Western-blotting方法,确定四株单抗识别的B细胞表位范围,化学合成该范围内的六段短肽,间接ELISA结果显示四株单抗均识别同一个线性表位：10GHPGGPSQEVDG21。该表位的发现丰富了JEV的抗原表位图谱,并为NS1’蛋白相关功能的研究奠定了基础。