论文部分内容阅读
目的:膀胱癌发病率在中国泌尿系统恶性肿瘤中排名第一,在西方国家仅次于前列腺癌。随着对膀胱癌机制的研究,膀胱癌的治疗手段日新月异,膀胱癌患者的预后生存期和生活质量逐年提高。但是,高级别肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer,MIBC）的高复发率、高转移率,仍然给膀胱癌的治疗带来极大困难。近年来的医学基础研究表明,肿瘤细胞的上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）和干细胞样特性是恶性肿瘤生长、增殖、侵袭、转移的重要机制。因此,明确MIBC的EMT和干性的调控机制对于改善膀胱癌的治疗,延长膀胱癌病人的生存期,提高病人生存质量,有非常重要的意义。现阶段的研究证明,WNT通路在多种肿瘤中存在重要的调控作用,WNT7B更是参与了一些肿瘤的发生发展过程。但是,对于WNT7B在膀胱癌细胞中的调控机制鲜有人报道。本研究通过检测膀胱癌组织标本和膀胱癌细胞系的WNT7B和其他调控分子的表达情况,明确WNT7B对于膀胱癌细胞EMT和干性特征的调控机制,为MIBC提供新的治疗方向和精准治疗的靶点。研究方法:1.通过TCGA数据库分析WNT7B在膀胱尿路上皮癌中不同病理分级中的差异表达和WNT7B表达与生存时间的关系。在膀胱尿路上皮癌临床病理组织标本中,选择高级别病理组织22例,低级别病理组织15例,应用免疫组织化学方法检测WNT7B在临床病理标本中的表达水平,并分析WNT7B表达水平和生存时间的关系。参考CCLE数据库分析不同膀胱尿路上皮癌细胞系中WNT7B的表达水平,选择RT4、J82和UM-UC-3三种膀胱尿路上皮癌细胞系用作后续实验。2.采用慢病毒载体构建WNT7B过表达的J82、UM-UC-3稳定转染细胞系和慢病毒载体构建WNT7B敲减的RT4稳定转染细胞系。通过Western blot,Real-time PCR、CCK8和流式细胞分析方法,对WNT7B过表达的J82、UM-UC-3和WNT7B敲减的RT4稳定转染细胞系进行检测,明确WNT7B对β-catenin信号通路、细胞生长和凋亡的影响。3.研究WNT7B对膀胱尿路上皮癌EMT和肿瘤细胞干性特征的影响:通过TCGA和CCLE数据库,分析膀胱尿路上皮癌组织标本和膀胱尿路上皮癌细胞系中,WNT7B与上皮和间质相关标记物的相关性。采用构建的WNT7B过表达的J82、UM-UC-3和WNT7B敲减的RT4细胞系,通过Western blot、免疫荧光和Real-time PCR实验技术检测转染效率和WNT7B对上皮间质表型和干性标志物的影响;通过鬼笔环肽免疫荧光染色检测细胞形态变化;通过Transwell实验技术检测WNT7B对肿瘤细胞系侵袭能力的影响;通过细胞划痕实验检测WNT7B对肿瘤细胞系迁移能力的影响;通过肿瘤成球实验检测WNT7B对肿瘤细胞干性的影响;采用CCK8试剂盒检测WNT7B对肿瘤细胞耐药性的影响。4.明确WNT7B调控膀胱尿路上皮癌EMT和干性的作用机制:通过TCGA和CCLE数据库,分析膀胱尿路上皮癌组织标本和膀胱尿路上皮肿瘤细胞系中,FZD5与上皮和间质标志物的相关性;应用Co IP实验,明确WNT7B与FZD5是否存在相关结合关系;采用慢病毒载体构建FZD5敲减的RT4稳定转染细胞系,通过免疫荧光实验和Transwell试验测定FZD5对膀胱尿路上皮肿瘤细胞的上皮间质表型标志物和细胞侵袭能力的影响;采用Western blot、Real-time PCR、耐药试验和细胞成球实验检测FZD5敲减的转染效率和FZD5对膀胱尿路上皮癌细胞干性的影响;采用慢病毒载体构建FZD5敲减的J82稳定转染细胞系,并在此基础上继续采用慢病毒载体构建FZD5敲减并且WNT7B过表达的J82稳转细胞系,采用Western blot和Real-time PCR实验检测转染效率;通过免疫荧光实验、划痕实验、细胞成球实验和耐药试验,测定WNT7B对FZD5敲减的膀胱尿路上皮肿瘤细胞系的EMT和干性特征的影响;通过TCGA和CCLE数据库,分析ELF3和WNT7B、FZD5以及EMT相关标志物的相关性;采用WNT7B和FZD5敲减的RT4两种稳转细胞系,采用Western blot和Real-time PCR实验测定WNT7B和FZD5对膀胱尿路上皮肿瘤细胞ELF3表达的影响;采用WNT7B敲减的RT4稳转细胞系和野生型的J82细胞系,过表达ELF3后,通过Real-time PCR、Transwell实验、成球实验和耐药实验,测定ELF3对WNT7B敲减的RT4稳转细胞系和J82的EMT和干性的影响;通过CCLE数据库,分析NOTCH1与WNT7B、FZD5、ELF3的相关性;采用WNT7B和FZD5敲减的RT4两种稳转细胞系,采用Western blot和Real-time PCR实验测定WNT7B和FZD5对膀胱尿路上皮肿瘤细胞NOTCH1表达的影响;采用Ch IP实验分析ELF3对NOTCH1的转录调控作用;采用WNT7B敲除的RT4稳转细胞系和野生型的J82细胞系,分别过表达ELF3和NOTCH1后,通过Western blot实验测定,过表达ELF3对NOTCH1表达的影响;通过Real-time PCR和鬼笔环肽染色,检测过表达NOTCH1对肿瘤细胞EMT的影响;通过成球实验和耐药试验,检测过表达NOTCH1对肿瘤细胞干性的影响。结果:1.WNT7B在低级别膀胱尿路上皮癌中高表达,WNT7B高表达的膀胱尿路上皮癌患者能获得更长的生存时间。2.WNT7B不参与调控膀胱尿路上皮癌细胞经典β-catenin通路,不影响膀胱尿路上皮癌细胞的生长和凋亡。3.WNT7B在不同膀胱尿路上皮癌细胞系中正向调控上皮样表型相关因子。WNT7B过表达的J82细胞系,CDH1、E-cadherin表达增多,VIM、ZEB1、Vimentin表达减少,细胞向上皮形态转化,细胞的迁移、侵袭能力下降。WNT7B过表达的UM-UC-3细胞系,CDH1表达增多,VIM、ZEB1表达减少,细胞的迁移、侵袭能力下降。WNT7B敲减的RT4细胞系,CDH1、E-cadherin表达减少,VIM、ZEB1、Vimentin表达增多,细胞向间质形态转化,细胞的迁移、侵袭能力增强。4.WNT7B在不同膀胱尿路上皮癌细胞系中负向调控细胞干性相关因子。WNT7B过表达的J82细胞系和UM-UC-3细胞系,CD44表达减少,抑制了IL-6/Stat3通路,细胞成球能力和耐药性减弱。WNT7B敲减的RT4细胞系,CD44表达增多,促进了IL-6/Stat3通路,细胞成球能力和耐药性增强。5.FZD5与WMT7B具有相似的表型特征,Co IP实验证实FZD5与WNT7B在RT4细胞中相互结合。6.FZD5正向调控膀胱尿路上皮癌细胞的上皮样表型相关因子。FZD5敲减的RT4细胞系,E-cadherin表达减少,Vimentin表达增多,细胞的侵袭能力提高。7.FZD5负向调控膀胱尿路上皮癌细胞的干性相关因子,FZD5敲减的RT4细胞系,WNT7B表达没有明显变化,CD44表达增多,上调了IL-6/Stat3通路,细胞的成球能力和耐药性增强。8.在FZD5敲减的RT4细胞系基础上过表达WNT7B,细胞的E-cadherin和Vimentin表达没有明显变化,细胞的迁移、成球能力和耐药性没有变化。提示WNT7B通过结合FZD5发挥调控膀胱尿路上皮癌细胞EMT和干性特征的功能。9.结合TCGA和CCLE数据库,在膀胱尿路上皮癌标本组织和细胞系中,ELF3与WNT7B、FZD5正相关,与EMT标志物ZEB1、ZEB2负相关。分别敲减WNT7B和FZD5都会减少RT4细胞中ELF3的表达。在WNT7B敲减的RT4细胞系中过表达ELF3,VIM、ZEB1减少,细胞迁移、成球能力和对化疗药物的耐药均减弱。ELF3过表达的J82细胞系也有一样的表型特征,即VIM、ZEB1表达减少,细胞迁移、成球能力和耐药性均减弱。10.结合CCLE数据库,在膀胱尿路上皮癌细胞系中,NOTCH1和WNT7B、FZD5、ELF3正相关。分别敲减WNT7B和FZD5都会减少RT4细胞中NOTCH1的表达。Ch IP实验证实了ELF3与NOTCH1启动子序列能够发生结合,ELF3参与转录调控NOTCH1。WNT7B敲减的RT4细胞系过表达ELF3,会增加NOTCH1的表达。WNT7B敲减的RT4细胞系过表达NOTCH1,会减少VIM的表达,细胞形态会趋向于上皮形态,细胞的成球能力和耐药性下降。ELF3过表达的J82细胞,NOTCH1表达增加。NOTCH1过表达的J82细胞,VIM表达减少,细胞形态会趋向于上皮形态,细胞的成球能力和耐药性下降。结论:1.WNT7B在低级别膀胱尿路上皮癌组织中高表达,且提示预后良好和较长的生存期。2.WNT7B抑制膀胱尿路上皮癌细胞的EMT和干性。3.WNT7B/FZD5通过调控ELF3-NOTCH1轴抑制膀胱尿路上皮癌细胞EMT和干性,其通路可作为治疗膀胱尿路上皮癌的靶点。