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背景和目的:结直肠癌（colorectalcancer,CRC）是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤,发病率在全球恶性肿瘤中居第三位,死亡率居第二位。近10年来,我国结直肠癌的发病率和死亡率呈上升趋势,已成为危害人民健康的突出问题。结直肠癌患者预后不理想,迫切需要新的治疗方案。分子靶向治疗因其高效、低毒的优点,已成为结直肠癌治疗的新趋势。因此,研究结直肠癌发生发展的分子机制,寻找新的靶向治疗的生物标志物,有望使患者从新的治疗策略中受益。Forkhead box（FOX）F2是Forkhead box转录因子超家族的一员,在乳腺癌等多种肿瘤中发挥抑癌性调控作用。然而,FOXF2在结直肠癌发生发展中的作用及机制尚不清楚。前期研究发现FOXF2在结直肠癌中的表达显著降低,因此我们推测FOXF2在结直肠癌中起到抑癌性调控作用,结直肠癌中可能存在以FOXF2为中心的分子调控网络。同时,高海拔地区存在低氧状况,缺氧通过调节多个低氧适应相关转录因子及其下游靶基因来影响肿瘤代谢,缺氧在实体肿瘤中被证实可以促进肿瘤恶性生物学行为,本研究拟明确FOXF2对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的调控作用,初步探讨缺氧在调控FOXF2表达方面起到的作用,鉴定FXOF2下游效应靶基因及调控方式,为结直肠癌中可能存在的FOXF2调控网络提供理论依据。PRUNE2与前列腺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤和黑色素瘤密切相关,而其在结直肠癌中的作用研究还未见报道。我们前期利用生物信息学方法分析了FOXF2和PRUNE2基因在结直肠癌组织中的表达情况,发现二者表达呈正相关,而PRUNE2基因启动子区域含有FOXF2的潜在结合位点,我们因此推测FOXF2可能在结直肠癌中对PRUNE2具有调控作用,并影响结直肠癌细胞的生物学行为,并明确缺氧在其中起到的作用。方法:利用生物信息学分析TCGA数据库评价FOXF2和PRUNE2在结直肠癌中的表达情况,以及其与患者预后的关系。JASPAR数据库预测PRUNE2启动子区内FOXF2的潜在结合位点。RNA-seq测序筛选FOXF2 下游的潜在靶基因。双荧光素酶报告基因实验评价FOXF2与PRUNE2启动子区的结合活性。利用慢病毒感染方法分别建立稳定表达FOXF2、PRUNE2以及稳定敲低PRUNE2的SW620 和 HT29 细胞。CCK-8、Transwell、克隆形成、PI-Annexin V 染色方法用于检测体外功能实验中SW620和HT29细胞的增殖、侵袭、细胞周期以及凋亡水平。裸鼠皮下移植瘤模型用于评价FOXF2和PRUNE2对HT29细胞体内成瘤能力的影响。免疫印迹和qPCR方法用于检测FOXF2和PRUEN2的蛋白及mRNA水平变化。氯化钴处理用于建立SW620和HT29的缺氧培养模型。结果:生物信息学分析发现,FOXF2在结直肠癌患者中的表达显著降低,免疫组化和蛋白印迹结果也表明,FOXF2蛋白在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织。正常人结肠上皮细胞（FHC）和6株人结直肠癌细胞系（SW620,SW480,HT29,HCT116,LOVO,LDL-1）的蛋白印迹检测发现,FOXF2在6株结直肠癌细胞系中的表达均显著低于正常人结肠上皮细胞。我们利用FOXF2表达慢病毒建立稳定表达FOXF2的SW620和HT29细胞用于体外和体内功能实验。体外功能实验结果提示,恢复FOXF2的表达能够显著抑制SW620和HT29细胞的增殖、侵袭及细胞周期进程,促进了细胞凋亡。裸鼠体内移植瘤实验进一步证实,FOXF2恢复表达后HT29细胞体内成瘤能力受到明显抑制。因此我们认为FOXF2在结直肠癌中起到抑癌性调控作用。我们进一步利用RNA-seq测序筛选可能受FOXF2调控的下游靶基因。分析结果发现PRUNE2随FOXF2表达上调而显著上调。考虑到已有研究发现PRUNE2在前列腺癌等癌症中发挥抑癌性作用,同时PRUNE2编码基因启动子区域含有多个FOXF2的潜在结合位点,因此我们推测PRUNE2可能作为靶基因受到FOXF2转录调控。利用生物信息学分析发现,PRUNE2表达在结直肠癌患者中的显著降低,且PRUNE2高表达的患者的无复发生存率明显高于PRUNE2低表达的患者。免疫组化和蛋白印迹结果也表明,PRUNE2蛋白在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织。正常人结肠上皮细胞（FHC）和6株人结直肠癌细胞系（SW620,SW480,HT29,HCT116,LOVO,LDL-1）的蛋白印迹检测发现,PRUNE2蛋白在6株结直肠癌细胞系中的表达均显著低于正常人结肠上皮细胞。体外功能实验结果表明,恢复PRUNE2的表达显著抑制了 SW620,HT29细胞增殖、侵袭及细胞周期,促进了细胞凋亡;而PRUNE2沉默后促进了 SW620,HT29细胞增殖、侵袭和细胞周期,抑制细胞凋亡。裸鼠移植瘤实验证实,PRUNE2恢复表达后HT29细胞体内成瘤能力显著抑制。生信分析预测在PRUNE2启动子区域有17个潜在的FOXF2结合位点,我们利用双荧光素酶报告基因检测证实FOXF2与PRUNE2启动子-1800—-1000bp区域有明显的结合活性,提示FOXF2能够转录调控PRUNE2的表达。功能挽救实验发现,恢复FOXF2表达后,PRUNE2表达随之上调,且SW620和HT29细胞的增殖、侵袭能力明显下降。而利用siRNA再次抑制PRUNE2表达后,上述细胞增殖、侵袭能力获得部分恢复。我们也初步探讨了 FOXF2在结直肠癌中表达异常降低的原因。缺氧培养SW620和HT29细胞,其FOXF2 mRNA水平进一步降低,我们推测肿瘤实体中的缺氧微环境可能是引起结直肠癌FOXF2异常降低的原因之一。结论:FOXF2作为抑癌性转录因子通过转录调控PRUNE2表达发挥对结直肠癌的生长发展的抑制性作用。缺氧微环境可能是FOXF2在结直肠癌中异常低表达的原因之一。FOXF2和PRUNE2有望成为结直肠癌重要的生物标志物和潜在治疗靶点。