论文部分内容阅读
酶在经过固定后对温度和p H的耐受能力增强且能多次重复使用,因此,固定化酶技术在生物工程、化学工程和医学等领域得到了广泛的应用。其中,利用现有材料设计和开发性能优良且价格低廉的载体是固定化酶重要的研究方向。有机-无机杂化载体综合了有机材料和无机材料的优点,是固定化酶的理想载体之一。而基于仿生矿化方法合成有机-无机杂化载体具有诸多优点,包括合成条件温和,有机成分诱导无机矿物的形成可调控无机矿物的形貌和大小等。因此,本论文研究利用聚合物或酶作为有机成分,碳酸钙或磷酸铜作为无机成分,制备具有一定比表面积和形貌的有机-无机杂化载体分别用于固定胰激肽释放酶、乳酸脱氢酶和α-葡萄糖苷酶,对其进行酶促动力学研究并应用于天然产物的酶抑制活性评价。本论文包括五个章节的内容,其中包括三个章节的实验研究。第一章为文献综述,首先介绍了固定化酶,包括固定化酶体系、优势和特点。其次,总结了目前固定化酶的几种方法。然后阐述了固定化酶载体,包括有机载体、无机载体、有机-无机杂化载体,并对仿生矿化法及其制备的有机-无机杂化载体进行了综述。此外,总结了固定化酶酶促动力学、抑制动力学及批次间重现性、重复使用性、储存稳定性的评价方法。最后提出了本论文的研究目的、意义及内容。第二章的研究内容为聚苯乙烯磺酸钠介导的仿生矿化合成磁性微球用于胰激肽释放酶的固定化并应用于天然化合物的酶抑制活性评价。首先利用自发矿化的方法制备聚苯乙烯磺酸钠介导的碳酸钙磁性微球固定胰激肽释放酶,并使用多种表征技术对材料的结构进行了研究。然后优化酶促反应条件,并对酶的相关参数进行测定。结果固定化激肽释放酶的最适p H和温度分别为7.5和75°C,且经过七次连续使用能保持82%的初始活性。测得固定化酶的米氏常数（Km）为3.30 m M,丝氨酸蛋白酶抑制剂（AEBSF）对其半数最大抑制浓度(IC50)为67.04μM。最后,结合毛细管电泳（CE）分析,将该固定化酶应用于十个天然化合物的抑制活性评价,结果小檗碱、黄连碱、药根碱和吴茱萸内酯具有较好的胰激肽释放酶抑制活性,抑制率分别为（43.11±1.74）%、（34.40±1.88）%、（37.98±1.65）%和（28.47±1.04）%。采用分子对接分析进一步预测了它们与酶的结合能大小和结合方式。总之,仿生矿化法制备载体是一种简便、可靠的固定化酶方法,可拓展用于其他酶的固定化研究。第三章研究内容为仿生矿化合成有机-无机杂化纳米花固定乳酸脱氢酶（LDH）及其在抑制剂筛选中应用。首先以Cu3（PO4）2·3H2O作为无机成分、LDH作为有机成分合成纳米花直接固定酶。通过多种表征技术对LDH杂化纳米花结构进行研究后,对酶促反应条件进行了优化,同时测定了酶促反应动力学和抑制动力学参数。结果固定化LDH的最适p H和温度分别为6.5和60°C,循环使用七次后能保持最初活性的51%左右。测得固定化LDH的Km为3.05 m M,已知抑制剂Galloflavim对其的IC50为76.85μM。最后,利用该固定化酶对十个天然化合物进行了抑制剂活性评价,其中葛根素芹菜糖苷、芦荟苷A、新绿原酸、淫羊藿苷等四个化合物对LDH具有显著的抑制活性,抑制率分别为（53.83±2.82）%、（49.64±1.31）%、（41.42±1.45）%和（34.54±0.47）%。最后,采用分子对接预测了四个活性成分与酶的结合能和结合位点。第四章研究内容为植酸修饰α-葡萄糖苷酶（α-Glu）/Cu3（PO4）2·3H2O杂化纳米花的制备及其应用。在第三章的基础上,利用植酸（PA）的性质增大纳米花的比表面积和稳定性,使得固定化α-Glu的稳定性得到提高。通过多种表征技术对材料的结构性能进行了研究,然后对酶促反应的p H值、温度等条件进行了优化,测定了酶促反应动力学和抑制动力学参数。相比于游离酶,固定化α-Glu在较宽的p H范围和高温条件下具有更好的酶活性。经过七次循环使用后,植酸修饰固定化α-Glu仍能保持初始固定化酶活性的63%左右。测得固定化α-Glu的Km和阿卡波糖对其IC50值分别为0.77 m M和15.01μM。最后,将固定化α-Glu用于十个多酚类化合物的抑制活性评价。结果表明,表儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（GCG）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和迷迭香酸的抑制率分别为（53.42±2.39）%、（37.28±1.32）%、（37.0±0.63）%和（35.53±0.23）%。使用分子对接进一步分析预测化合物与酶作用的机制。总之,PA修饰的杂化纳米花是一种有效的α-Glu固定化方法,可进一步固定其他酶用于生物催化和生物传感等领域。第五章为结论与展望。本论文基于仿生矿化合成有机-无机杂化载体,综合了有机载体的生物相容性,同时也保持了无机载体优异的机械性能,用于酶的固定简便且具有一定的稳定性。这些载体为其他酶的固定和应用提供了更多的选择,筛选出的抑制剂也为相关疾病的治疗药物研发提供了一定的参考。