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青霉素酰化酶(PA)及其固定化酶在半合成抗生素产业中发挥着十分重要的作用。本文用硅藻土和氨基化二氧化硅作为固定青霉素酰化酶的载体,开展了载体的预处理、修饰或合成、酶的固定化及催化性能等工作。并应用TG-DTA、FT-IR、SEM、TEM等测试手段对载体进行了表征。
考察了载体的预处理、硅烷化和戊二醛活化过程中各因素对共价固定化酶活性的影响。结果表明:用硝酸处理硅藻土可得到操作稳定性较好的固定化酶;当戊二醛活化的浓度(v/v)为20%,pH值为6.5和反应时间为1h时,固定化酶的活性最高;硅烷化反应中,氮气保护,在较高的硅烷化温度下反应较长时间可提高固定化酶的活性;共价固定化酶初始活性约为700~900U/g(干重),用磷酸缓冲液洗涤6次之后活性保留98%,重复操作10次之后活性保留63%。
研究了载体的预处理和固定化过程中各因素对吸附固定化酶活性的影响。结果表明:预处理之前在700℃焙烧,低浓度的硝酸处理较短时间,可得到较高活性的固定化酶;固定化的最优条件为:固定化温度为30℃,每克硅藻土的最大载酶量为2mL(650~750U/mL),固定化时间为12h;吸附固定化酶的初始活性约为900~1100U/g(干重),用磷酸缓冲液洗涤3次之后活性保留92%,重复操作10次之后活性保留54%。
通过用氨基化二氧化硅进行青霉素酰化酶固定化的初步探索性实验可看出:在反相微乳液中,按V环己烷:VTritonX-100:V正己醇:V氨水:VTEOS:VAPTES=24:12:12:10:5:5的比例合成的载体,氨基含量为4.84mmol/g,比表面积为23m2/g,所得固定化酶的活性高达2214U/g;氨基化二氧化硅为无定形结构,属球形颗粒,粒径大小为100nm左右且分布均匀,氨基含量可调节;固定化酶在重复操作5次之后活性保留96%,在pH=7.9的缓冲液中于4℃储存48天之后活性保留98%。
研究结果表明,硅藻土固定化酶的重复性较差,使其很难进行工业化应用,而氨基化二氧化硅是一种优良的固定青霉素酰化酶的载体,有望进行工业化生产。