急性呼吸道感染（Acute Respiratory Tract Infection,ARTI）是一种常见的传染性疾病,主要由呼吸道病毒引起,严重威胁人类生命财产安全,近年来世界卫生组织不断呼吁各国加大对呼吸道病毒的防控力度。呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）、人冠状病毒HKU1（Human coronavirus HKU1,HCo V-HKU1）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-Co V-2）等呼吸道病毒感染后的临床症状高度相似,需要借助其他方法进行病原学诊断。因此,建立一种简便有效、敏感特异的现场即时检测（point-of-care testing,POCT）方法,对于快速筛查和诊断呼吸道病毒至关重要。本研究借助toehold switch元件、无细胞系统和纸基载体实现对HCo V-HKU1、SARS-Co V-2、RSVA和RSVB的可视化检测。结合核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification,NASBA）等温扩增提高检测灵敏度,通过基于toehold switch元件的纸基无细胞传感器摆脱对复杂设备和专业操作人员的依赖。利用NUPACK软件在HCo V-HKU1、SARS-Co V-2、RSVA和RSVB检测基因的高度保守特异序列中设计toehold switch元件,构建含有不同候选switch序列的重组质粒p ET28a-switch-Lac Z,在无细胞系统中验证候选toehold switch元件的本底泄漏情况及检测能力,根据溶液颜色及A570/A420相对吸光度值变化筛选出针对HCo V-HKU1、SARS-Co V-2、RSVA、RSVB的SC10、SR7、SA13、SB2 toehold switch元件。建立NASBA等温扩增体系并优化扩增引物和时间,使用优化后的体系进行等温扩增,结合15%尿素变性聚丙烯酰胺凝胶检测HCo V-HKU1、SARS-Co V-2、RSVA、RSVB的检测限分别为78a M、63 a M、520 p M、910 a M。观察NASBA结合toehold switch元件在液体无细胞系统、纸基无细胞传感器中的反应情况,综合评价检测方法的特异性、交叉性和灵敏度。结果表明SC10、SR7、SA13、SB2 toehold switch元件的特异性较好且不存在交叉反应,在液体无细胞系统中检测HKU1、SARS-Co V-2、RSVA、RSVB的灵敏度分别为78 a M、63 a M、52 a M、91 a M,在纸基无细胞传感器中检测限为78 a M、63 a M、5.2 f M、91 a M。综上所述,本研究利用NASBA结合基于toehold switch元件的纸基无细胞传感器提供了一种比色检测呼吸道病毒的方法,通过两步级联放大信号和两次特异性识别显著提高了检测方法的灵敏度和特异性。无细胞系统冻干于便携纸基后有利于稳定储存运输,适用于设施简陋、经验不足的基层医疗单位对采集样本进行POCT诊断,对呼吸道病毒的及时防控、流行病学分析和疫苗研发具有重要意义。