白花丹醌对人肝星状细胞增殖、凋亡及分泌功能影响的研究

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目的:观察白花丹的药用活性成分白花丹醌对人肝星状细胞的作用,了解其对该细胞的生长和功能的影响,并进一步探究其作用的靶位点和分子机制。为白花丹的抗肝纤维化作用提供重要的科学依据,为开发利用盛产于广西的药用植物白花丹治疗肝纤维化作出理论和实验的铺垫。  方法:培养人肝星状细胞株(HSC-LX2),移入孔板后按孔数将细胞分成6组:空白对照组(第1组)、白花丹醌低浓度组(第2组)、中浓度组(第3组)、高浓度组(第4组)、秋水仙碱阳性对照组(第5组)、复方鳖甲软肝片阳性对照组(第6组)。按各组要求往细胞孔内加入相应的工作液。培养孵育48h后,用四氮噻唑蓝(MTT)比色法测定细胞的吸光度值,计算增殖抑制率。用流式细胞术(PI染色法)检测各周期细胞的DNA含量及细胞晚期凋亡的概况。用流式细胞术(ANNEXIN V-PE/7-AAD双染色法)检测细胞凋亡各阶段的情况。用免疫组化法染色观察Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、α-肌动蛋白(α-SMA)沉积的部位和面积。  结果:1.MTT检测结果:低、中、高浓度白花丹醌均可抑制HSC-LX2细胞的增殖,48h的增值抑制率分别为25.4%、75.1%、96.8%。48h的IC50为4μmol/L。增殖抑制能力呈剂量依赖性。差异有高度显著的统计学意义(p<0.01)。  2.流式细胞术检测结果:(1)PI染色:低、中、高浓度白花丹醌均可阻止HSC-LX2细胞进入DNA合成增殖周期,并诱导其进入晚期凋亡阶段。48h的S期+G2/M期细胞总数百分比分别为70.1%、47.6%、36.5%;晚期凋亡率分别为13.4%、24.8%、31.5%。呈剂量依赖性,差异有高度显著的统计学意义(p<0.01)。(2)ANNEXIN V-PE/7-AAD双染色:低、中、高浓度白花丹醌均可诱导HSC-LX2细胞发生早期及晚期凋亡,48h的总凋亡细胞百分比分别为20.6%、35.4%、49.4%。其诱导凋亡的能力呈剂量依赖性。差异有高度显著的统计学意义(p<0.01)。  3.免疫组化检测结果:低、中、高浓度白花丹醌均抑制HSC-LX2细胞分泌Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白、α-SMA和TGF-β1的能力,用药后该4种蛋白表达均减弱,表达的面积缩小,颜色从棕黄色变为浅黄色。蛋白表达积分明显降低。且具有剂量依赖性,经统计学分析差异均有高度显著性(p<0.01)。  4.中、高浓度白花丹醌组对HSC-LX2细胞的增殖抑制、阻止细胞进入DNA合成增殖周期、诱导细胞凋亡、抑制分泌蛋白功能的能力均明显比秋水仙碱组和复方鳖甲软肝片组强,差异均具有高度显著性(p<0.01)。  结论:1.白花丹醌具有抑制HSC-LX2细胞增殖、阻止细胞进入DNA合成增殖周期、诱导细胞发生早期及晚期凋亡、降低HSC-LX2细胞的蛋白分泌功能的能力,从而可以干预肝纤维化。且具有剂量依赖性。  2.中、高剂量的白花丹醌,在抑制HSC-LX2细胞的增殖、阻止细胞进入DNA合成增殖周期、诱导细胞发生早期及晚期凋亡、降低HSC-LX2细胞的蛋白分泌功能方面显示的能力,均明显比秋水仙碱组和复方鳖甲软肝片组强。
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