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椎间盘退变(IVDD)及类风湿关节炎(RA)是常见的慢性骨关节疾病。二者发病率高,治疗难度大,复发率高,给患者身体健康及生活质量带来较大威胁,为国家社会造成重大经济负担。在两者发病过程中,炎症免疫反应均发挥作用:免疫豁免丧失后,抗原物质暴露并被机体免疫系统识别,激活免疫级联反应,引起免疫病理损伤。间充质干细胞是干细胞疗法中最常见的细胞类型,具有治疗潜力大、免疫原性低、应用范围广的特点。作为间充质干细胞的重要组成类型,牙髓干细胞(DPSCs)具有较强的自我更新能力、突出的免疫调控作用和出色的成软骨/成骨特性。科室前期研究证明,DPSCs能够抑制炎症,促进组织修复,在慢性牙周病软硬组织缺损中发挥较好的治疗作用。由于自身免疫反应在牙周炎的发病过程中同样占据举足轻重的地位。由此,我们推测DPSCs对自身免疫反应相关炎症所致疾病具有潜在免疫调节作用。基于以上因素,我们考虑使用DPSCs对IVDD及RA动物模型进行治疗,分析DPSCs对二者的治疗作用;并通过分离患者原代细胞,研究DPSCs在二者中发挥作用的相关机制。本研究主要分以下四部分进行。第一部分:目的评估DPSCs对大鼠IVDD模型椎间盘结构及细胞外基质的影响。方法使用针刺髓核法构建大鼠IVDD模型,原位注射DPSCs进行治疗。使用Micro-CT对大鼠IVDD病变情况进行影像学评估。使用H&E染色、Masson染色、番红固绿染色和免疫组织化学染色以及Masuda评分和形态结构参数定量分析对大鼠椎间盘病变及细胞外基质进行组织病理学评估。结果Micro-CT结果证明:DPSCs治疗后,椎间盘高度恢复,影像学表现良好。组织病理学结果证实:DPSCs治疗后,椎间盘组织结构趋于恢复,纤维环与髓核界限清楚,髓核细胞数量恢复;软骨终板肥厚及髓核萎缩均有所缓解;髓核中II型胶原(Col II)分泌增加,细胞外基质增多。结论DPSCs促进IVDD动物模型椎间盘结构恢复及细胞外基质产生。第二部分:目的分析DPSCs培养上清对椎间盘突出患者原代髓核细胞基因表达及信号通路的影响,明确DPSCs治疗后髓核细胞变化的分子机制。方法使用DPSCs上清处理患者原代髓核细胞后进行转录组测序。通过对测序结果进行生物信息学分析,找出差异表达基因(DEGs)及富集的信号通路。使用Western blotting及免疫荧光染色验证测序结果并分析髓核细胞表型变化。结果转录组测序结果证明:DPSCs上清处理后,炎症相关基因如IL6、CCL7、IL1RL1、TNFAIP6等明显下调,髓核细胞功能相关基因如PIK3R1、ITGA10、IGFBP2和LEP等明显上调;GO分析提示,炎性因子分泌及结合过程减弱,细胞外基质分泌增强;Pathway富集分析提示,上调基因主要富集到与细胞外基质分泌相关的信号通路(如弹性纤维和胶原蛋白产生相关信号通路),下调基因主要富集与炎症相关的信号通路(如Jak-STAT信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路等)。Western blotting结果证实:DPSCs上清处理后,髓核细胞IL-6分泌减少,Col II分泌增加,细胞凋亡相关蛋白Cleaved-Caspase-3表达降低;NF-κB及STAT3信号通路活化降低,Akt信号通路活化增加。免疫荧光染色证明:DPSCs培养上清处理后,髓核细胞F-actin组成的丝状骨架结构相对完整,降解较少,细胞凋亡水平降低,功能保持完好。结论DPSCs上清处理抑制髓核细胞炎症相关信号通路活化,减少炎性因子释放,保护髓核细胞存活及功能。第三部分:目的评估HGF修饰的DPSCs(DPSCs-HGF)及对照基因修饰的DPSCs(DPSCs-Null)治疗对小鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型临床表现、病理学和影像学的影响。方法使用腺病毒载体在DPSCs中过表达具有免疫调控及免疫耐受重建作用的HGF分子,构建DPSCs-HGF细胞。静脉注射DPSCs-HGF细胞、对照细胞DPSCs-Null细胞或PBS治疗CIA模型。对CIA小鼠临床表现进行评分。使用H&E染色及Kreen评分标准对CIA小鼠关节滑膜炎进行组织病理学评估。使用Micro-CT对关节骨质破坏情况进行影像学评估。结果临床评分结果证明:DPSCs-Null治疗组小鼠关节肿胀相对较轻,关节表面红疹较少;DPSCs-HGF治疗组早期,小鼠临床评分较低,在治疗中后期小鼠关节炎评分迅猛升高。组织病理学结果证实:DPSCs-Null治疗组能够有效降低滑膜炎的严重程度;DPSCs-HGF治疗组实验终点关节腔内浸润炎症细胞增多,关节滑膜衬里层增厚,滑膜局部细胞密度增加。Micro-CT结果证明:DPSCs-Null及DPSCs-HGF治疗后,骨质破坏均有所缓解,二者无统计学差异。结论DPSCs-Null治疗能够减轻CIA小鼠临床表现,改善关节滑膜炎;DPSCs-HGF治疗早期对CIA小鼠临床症状有益,后期发生病情反弹,总体并无较好收益。第四部分:目的明确DPSCs-HGF治疗CIA小鼠关节炎后期发生病情反弹的机制。方法使用流式细胞术分析治疗后不同时间点CIA小鼠外周血免疫细胞亚型。使用多因子检测技术分析治疗后不同时间点CIA小鼠外周血炎症因子表达水平变化。使用免疫组织化学染色分析治疗后CIA小鼠关节局部IL-6分子表达。分离患者原代滑膜细胞后,使用HGF和/或抑制剂进行处理。通过细胞克隆形成实验、Western blotting及细胞周期染色实验分析髓核细胞增殖活性、凋亡情况、细胞周期等生物学特性变化。结果CIA小鼠外周血及关节免疫分析结果证明:DPSCs-HGF治疗后,小鼠外周血Treg细胞比例较早出现升高,但维持时间较短;且外周血Th1/Th2细胞比例升高;血清及关节局部IL-6分子在治疗后期迅猛增加;DPSCs-Null治疗后,小鼠Treg细胞比例升高现象出现相对晚,但升高幅度大,维持时间长;外周血Th1/Th2细胞比例较低;血清及关节IL-6保持较低水平。滑膜细胞离体实验证明:HGF分子以时间和剂量依赖性的方式促进滑膜细胞IL-6的分泌;DPSCs-HGF培养上清或外源补充HGF分子通过活化c-Met受体及下游Akt信号通路,诱导Survivin分子表达,增强滑膜细胞克隆形成能力和凋亡抵抗能力;使用抑制剂抑制c-Met、Akt分子活化或减少Survivin分子表达后,滑膜细胞出现G2/M期阻滞,CDK1及Cyclin B1分子表达降低,HGF引起的滑膜细胞克隆形成能力提高和凋亡抵抗能力增强被有效抑制。结论DPSCs-HGF治疗CIA模型,在疾病早期诱导Treg细胞上调,减少IL-6细胞因子分泌,控制关节炎临床表现;在疾病中后期,HGF分子通过激活c-Met受体,活化下游Akt信号通路,诱导Survivin蛋白表达,促进滑膜增殖及凋亡抵抗,加速关节炎的恶化。基于上述内容,本研究系统阐明:(1)DPSCs通过抑制髓核细胞炎症相关信号通路活化,减少炎性因子释放,保护髓核细胞存活及功能以及促进椎间盘结构恢复,发挥治疗IVDD的潜在作用。(2)DPSCs通过增加免疫抑制性Treg细胞,降低炎性Th1细胞比例及IL-6分泌水平以及控制滑膜炎症,发挥治疗RA的潜在作用。(3)HGF在治疗早期通过抑制免疫系统,发挥控制关节炎的作用;在治疗中后期,HGF通过激活滑膜细胞c-Met受体,活化下游Akt信号通路,促进滑膜细胞增殖及凋亡抵抗,发挥促进关节炎进展的作用。