论文部分内容阅读
目的:牙周炎是一组包含牙龈炎症和牙周组织破坏的慢性感染性疾病。目前在人群中的患病率很高,影响着人们的生活质量。在前期研究中发现:血清淀粉样蛋白（Serum amyloid A,SAA）与牙周炎的关系密切,但具体的调节机制需进一步研究。本研究旨在借助体外原代培养的健康人牙龈成纤维细胞（Human gingival fibroblasts,HGFs）和体内小鼠实验探究SAA在牙周炎症发展过程中对免疫细胞（白细胞）的募集作用,以期发现SAA在牙周炎中的重要作用,为进一步阐明牙周炎的致病机制以及完善其防治方法提供新的依据。方法:1.根据研究规定的纳入及排除标准筛选就诊于天津医科大学口腔颌面外科及牙周科的患者,签订知情同意书后采集牙龈组织。离体后马上放入RNA保护液或者含有10%青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液中低温保存,进行组织RNA提取以及组织块法原代细胞的培养。2.基因芯片检测人重组载脂蛋白-SAA（Apolippprotein-SAA,Apo-SAA）作用于HGFs 24 h后趋化因子mRNA的表达变化,应用实时定量聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）以及趋化因子固体蛋白芯片的方法对结果进行验证,并且进行差异性分析。3.实时定量PCR检测健康牙龈组织和炎性牙龈组织中趋化因子的表达。4.实时定量PCR检测1μg/m L脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）刺激si RNA-SAA预处理的健康HGFs中细胞趋化因子表达的变化。5.实时定量PCR检测10μg/m L Apo-SAA刺激TLR2抗体或者TLR2抑制剂（C29）预处理的健康HGFs中细胞趋化因子的表达。6.采用蛋白免疫印迹实验检测10μg/m L Apo-SAA处理健康HGFs后丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase,MAPK）以及核酸因子-κB（Nuclear factor-κB,NF-κB）信号通路激活情况。7.实时定量PCR检测10μg/m L Apo-SAA作用于c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）、p38以及核酸因子-κB抑制蛋白α（NF-κB inhibitorα,IκBα）、NF-κBp65抑制剂分别预处理的健康HGFs的趋化因子的表达。8.Transwell实验检测HGFs不同的条件培养液（LPS+对照si RNA组、LPS+si RNA-SAA组、LPS+Ig G组、LPS+anti-SAA组、Ig G组、anti-SAA组、Apo-SAA+Ig G组、Apo-SAA+anti-SAA组）对白细胞的趋化作用,利用CCK8的方法进行计数,并且应用流式细胞术分析募集后的白细胞中中性粒细胞、淋巴细胞（T细胞/B细胞）的比例变化。9.体内实验:构建牙周炎小鼠模型进行实验,并给予SAA抗体局部干预,通过上颌骨大体标本微计算机断层扫描技术（micro-computed tomography,micro-CT）观测以及牙龈组织伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色,观察炎症细胞的浸润情况以及小鼠牙槽骨高度的变化。结果:1.组织块法体外培养原代HGFs,显微镜下观察细胞呈长梭形、放射状排列,生长旺盛,状态良好。2.实时定量PCR以及趋化因子固体蛋白芯片结果显示:与非处理的HGFs比较,Apo-SAA处理后的HGFs中趋化因子:趋化因子（C-C基元）配体（Chemokine（C-C motif）ligand,CCL）2、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL20以及CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL10、CXCL11 mRNA以及蛋白表达都有明显增加。3.与健康牙龈组织相比,炎性牙龈组织中CCL2、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL20以及CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL10、CXCL11 mRNA明显上调。4.与非刺激组相比,1μg/m L脂多糖处理的细胞中CCL2、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL20以及CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL10、CXCL11 mRNA明显上调,并且可被si RNA-SAA抑制。5.Apo-SAA可明显促进TLR2 mRNA的表达,以及促进JNK、ERK、P38以及IκBα、NF-κBp65蛋白的磷酸化,并且TLR2抑制剂以及JNK、ERK、P38以及IκBα、NF-κBp65抑制剂都可明显抑制Apo-SAA诱导的趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL8、CCL13、CCL20以及CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL8、CXCL10、CXCL11 mRNA的上调。6.与LPS刺激的HGFs培养液相比,si RNA-SAA以及SAA抗体处理LPS刺激的HGFs后获得的培养液引起白细胞的浸润数量明显下降,而且Apo-SAA处理HGFs后所得培养液对白细胞的趋化明显,但SAA抗体可抑制这种效应。然而趋化后的白细胞中中性粒细胞、淋巴细胞（T细胞/B细胞）的比例并无明显变化。7.牙周炎模型中,与未处理的对照组相比,上颌骨大体标本micro-CT显示:SAA抗体局部干预的小鼠腭侧牙槽骨吸收在一定程度上得到缓解;牙龈组织HE染色显示:SAA抗体局部干预的小鼠牙龈结缔组织中炎症细胞的浸润（0.009±0.002）较Ig G对照组（0.017±0.002）明显减少。结论:1.炎性牙龈组织中趋化因子的升高,说明趋化因子参与牙周炎的发生发展过程。2.SAA可通过调节并激活HGFs表面受体TLR2、MAPK以及NF-κB信号通路诱导趋化因子的表达,进而促进白细胞的趋化,参与牙周炎症过程。3.抑制SAA-TLR2-MAPK/NF-κB信号通路可降低趋化因子的表达,而且局部抑制SAA可缓解牙周炎症和牙槽骨吸收,表明这一通路具有成为防治牙周炎的靶点的潜能。