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研究目的:创伤性颅脑损伤(Traumatic Brain Injury,TBI)是目前全球导致人类死亡和残疾的重要病因。神经炎症是创伤性脑损伤后急性神经功能缺损和慢性创伤性脑病的特征性病理改变。其在颅脑创伤后数分钟发生,并且可以持续较长时间,贯穿TBI起始及发展变化的整个过程,因此寻找一种能有效抑制过度神经炎症反应的手段对于改善神经功能预后至关重要。外泌体是细胞内的腔内囊泡与细胞膜融合后,主动分泌到细胞外的一种大小在30-100nm的细胞外囊泡。它内含脂质、蛋白质和核酸等活性物质,可通过与靶细胞受体结合并释放内容物等方式实现细胞间信号传导,从而发挥生物学功能。本实验重点研究了小胶质细胞外泌体中miRNA对受损神经元的影响,通过分析TBI急性期到慢性期小胶质细胞外泌体中miRNA的表达情况,寻找变化最显著的miRNA,并进一步探讨小胶质细胞外泌体中此miRNA对颅脑创伤后神经炎症和神经功能预后的影响和作用机制。方法:1.利用梯度离心外泌体提取技术对rTBI后3、7、14、28天的小胶质细胞外泌体进行提取,应用Western blot、透射电子显微镜和Nano Sight对提取的外泌体进行鉴定,通过miRNA高通量芯片技术对外泌体中miRNA进行检测,寻找表达量变化最为显著的miRNA。并通过q RT-PCR技术在r TBI后小胶质细胞及其分泌的外泌体中对此miRNA的表达量进行验证。使用流式细胞技术检测在小胶质细胞中调控目标miRNA后对小胶质细胞极化的影响。2.在体外神经元划痕损伤模型中,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测神经元炎症因子分泌情况;在小鼠r TBI模型中,利用q RT-PCR检测r TBI小鼠脑组织炎症因子的分泌情况。利用Western blot对miR-124-3p的作用通路进行研究,并且利用其激活剂进行验证;以及利用靶基因分析得到miR-124-3p与炎症相关的靶基因,并利用Western blot和荧光素酶报告实验进行验证。3.在体外神经元划痕损伤模型中,利用免疫荧光、探针跳跃式离子电导显微镜和Western blot检测受损神经突起改善情况;在小鼠rTBI模型中,利用水迷宫实验检测小鼠神经功能学预后。结果:1.在rTBI后3、7、14、28天收集小胶质细胞分泌的外泌体进行miRNA微阵列检测后发现,有16个miRNA的表达水平存在2倍以上的增加,其中miR-124-3p是表达水平增加最为显著的一个。并且通过miR-124-3p模拟物(mimics)上调小胶质细胞miR-124-3p的表达量之后,小胶质细胞会向M2型极化。2.(1)在体外神经元划痕损伤模型中加入上调miR-124-3p的小胶质细胞外泌体时,发现神经元分泌的肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)减少,而白介素-10(IL-10)增加。在小鼠r TBI模型中将上调miR-124-3p的小胶质细胞外泌体经鼠尾静脉注射,发现上调miR-124-3p的小胶质细胞外泌体可以减少TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌,增加IL-10的分泌。(2)在体外神经元划痕损伤模型中检测发现哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路参与miR-124-3p对神经炎症的调节。miR-124-3p可以抑制m TOR信号通路的活性。进一步通过靶基因预测和荧光素酶报告实验确认了miR-124-3p调控m TOR通路是通过靶基因PDE4B。3.在体外神经元划痕损伤模型中加入上调miR-124-3p的小胶质细胞外泌体时,发现可以抑制Rho A、淀粉样蛋白前体(APP)和磷酸化Tau蛋白(p-Tau)的表达,并且增加神经突起分支的数量和神经突起的总长度。在小鼠r TBI模型中将上调miR-124-3p的小胶质细胞外泌体经鼠尾静脉注射,发现其可以在水迷宫实验中减少小鼠逃逸潜伏期和增加目标象限停留时间。结论:1.在rTBI后,小胶质细胞外泌体中miR-124-3p的表达量升高最为显著,且miR-124-3p可以促进小胶质细胞向抑炎性M2型极化。2.在r TBI后,小胶质细胞外泌体及其表达的miR-124-3p通过靶向PDE4B抑制m TOR信号的活性,从而抑制神经炎症。3.在r TBI后,小胶质细胞外泌体及其表达的miR-124-3p促进神经突起生长,改善小鼠神经功能学预后。4.小胶质细胞外泌体及其表达的miR-124-3p可成为TBI后干预神经炎症的治疗靶点。调控miRNA的小胶质细胞外泌体可能为TBI或其他神经系统疾病的治疗提供一种新策略。