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研究目的:创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）是全球性的致死率和致残率都极高的一种疾病,除原发的机械性损伤外,其继发损伤可带来包括脑水肿、神经凋亡、神经炎症等一些列病理损害,进一步加剧原发损伤所造成的患者神经功能障碍甚至死亡。但目前在临床上尚缺乏有效的治疗手段,亟需对其发生发展机制进行进一步的探索。Semaphorin 3A（SEMA3A）作为semaphorin家族中的一类膜相关的蛋白,在神经系统中参与神经网络的构建。有关研究报道显示SEMA3A可影响血管的通透性,但其在创伤性脑损伤中的作用尚不得而知。本课题组在以往研究的基础上探究SEMA3A在创伤性脑损伤后血脑屏障破坏,神经凋亡方面的作用,更进一步研究其miRNA的调控机制,为寻求创伤性脑损伤的治疗提供新的靶点和依据。方法:1.使用控制性皮层打击装置（Cortical control impact,CCI）及成年雄性C57/BL6J小鼠制作小鼠脑创伤模型,在损伤周期中提取脑组织,并同时设立假手术组。通过Western blot检测SEMA3A及其相关受体的表达变化。并通过免疫荧光法检测SEMA3A在TBI后的表达区域。2.在脑组织中转染siRNA-SEMA3A或侧脑室注射SEMA3A重组蛋白在体内降低或增加SEMA3A的表达水平,通过m NSS改良神经功能评分评估创伤后的神经功能预后,并使用平衡梁行走实验（Beam walking test）对运动功能进行检测。使用伊文思蓝渗漏实验检测血脑屏障破坏情况。通过脑组织含水量评估脑组织水肿发生情况。最后通过Western blot检测血脑屏障连接蛋白表达。3.通过b End.3细胞系在体外建立血脑屏障模型。使用糖氧剥夺损伤（Oxygen-glucose deprivation,OGD）在体外建立脑外伤模型。使用Western blot检测OGD损伤后SEMA3A及其相关受体Nrp-1和Plexin-A1的表达变化。再通过转染si RNA-SEMA3A或加入SEMA3A重组蛋白在体外降低或增加SEMA3A的表达水平。通过transwell-dextran渗漏实验检测内皮屏障的破坏情况,以及探针跳跃式离子电导显微镜（HPICM）观察干预后内皮屏障的形态变化。最后通过Western blot检测内皮细胞中血脑屏障连接蛋白表达。4.使用qRT-PCR检测TBI后损伤周期及假手术组小鼠脑组织,以及体外OGD处理后的b End.3细胞和对照组的miRNA-30b-5p的表达水平。再通过agomir或antagomir在体内过表或敲低miRNA-30b-5p的表达水平,通过mimic或inhibitor在体外过表或敲低miRNA-30b-5p的表达水平,使用Western blot检测SEMA3A表达变化。通过双荧光素酶标记法（Luciferase）验证SEMA3A和miRNA-30b-5p的结合靶点。最后通过脑组织含水量检测、m NSS改良神经功能评分和平衡梁行走实验评价miRNA-30b-5p对TBI小鼠神经功能预后的影响。5.通过TUNEL检测试剂盒对神经元细胞凋亡情况进行检测。再通过Western blot对切割的caspase-9和caspase-3进行检测。最后再对通过agomir增加miRNA-30b-5p表达的TBI小鼠脑组织中切割的caspase-9和caspase-3进行检测,探究miRNA-30b-5p对TBI后SEMA3A造成的神经元凋亡的影响。结果:1.（1）TBI后,SEMA3A蛋白及其相关受体Nrp-1和Plexin-A1在脑外伤后1天开始升高,并在TBI后第3天达到高峰。（2）TBI后脑组织中SEMA3A集中分布于创伤灶周围的脑血管上。2.（1）SEMA3A可加重TBI后的神经功能障碍,而降低脑组织中SEMA3A的表达后可显著改善TBI后的神经功能预后。（2）降低SEMA3A表达可显著减少TBI后的血脑屏障破坏并改善脑组织水肿。（3）降低SEMA3A表达可降低TBI后连接蛋白VE-Cadherin的磷酸化。3.（1）OGD损伤可诱发内皮细胞中SEMA3A及其相关受体Nrp-1和Plexin-A1的分泌。（2）降低SEMA3A表达可改善OGD引起的细胞屏障渗漏。（3）SEMA3A可增大内皮屏障细胞间缝隙,而降低SEMA3A表达可改善OGD引起的内皮细胞间缝隙及数量。（4）降低SEMA3A表达可降低OGD引起的连接蛋白VE-Cadherin的磷酸化。4.（1）TBI后miRNA-30b-5p的表达水平在损伤后第1天开始下降,在损伤后第7天达到谷底,在体内过表达miRNA-30b-5p可降低TBI后SEMA3A的表达水平。（2）OGD损伤后miRNA-30b-5p的表达水平较对照组显著下降,且在内皮细胞中过表达miRNA-30b-5p后可降低OGD引起的SEMA3A表达升高。（3）miRNA-30b-5p可与SEMA3A的3’UTR区域结合,具有靶向关系。（4）增加miRNA-30b-5p的表达水平可显著改善TBI小鼠的神经功能预后,并减轻脑组织水肿。5.（1）降低SEMA3A蛋白表达水平可显著减少TBI后的TUNEL阳性神经元细胞数量。（2）降低SEMA3A蛋白表达水平可显著降低TBI后切割的caspase-9和caspase-3表达。（3）miRNA-30b-5p可显著改善SEMA3A造成的TBI后切割的caspase-9和caspase-3表达表达升高。结论:1.TBI后SEMA3A及其相关受体的表达水平显著升高,并集中表达于创伤灶周围。2.降低SEMA3A蛋白表达水平可显著改善TBI小鼠的血脑屏障破坏、脑组织水肿及神经功能障碍。3.OGD可造成b End.3内皮细胞系中SEMA3A及其相关受体表达升高,降低SEMA3A蛋白表达水平可显著改善OGD造成的内皮细胞屏障破坏,减少渗漏。4.在体内的TBI损伤及体外的OGD损伤后miRNA-30b-5p的表达水平显著降低,且miRNA-30b-5p可通过与SEMA3A的3’UTR区域结合降低SEMA3A的表达。5.SEMA3A蛋白可通过caspase-9/caspase-3通路促进TBI后神经元凋亡,且增加miRNA-30b-5p可显著改善这一情况。