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新城疫(Newcastle Disease,ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)引起的主要以禽类呼吸道和消化道渗出性炎症反应为主要特征的高度接触性传染病。NLRP3炎症小体介导着caspase-1的活化以及IL-1β的成熟和分泌,在病毒诱导产生的炎症反应中起着关键的免疫调节作用,但是目前关于鸡NLRP3炎症小体的功能研究鲜有报道,鸡NLRP3炎症小体在NDV引起的炎症反应中的功能值得探究。本研究主要内容如下:1.鸡源NLRP3炎症小体研究体系的建立本研究首先建立了鸡源NLRP3炎症小体的研究体系。本研究使用大肠杆菌原核表达系统表达caspase-1和IL-1β两种目的蛋白,然后通过切蛋白胶胶回收的办法,进行重组蛋白的纯化,免疫新西兰兔后制备的多克隆抗体经Western-Blot鉴定具有良好的特异性,在1:500稀释度下多克隆抗体能够检测出相应蛋白,证明能够用于鸡源NLRP3炎症小体的研究,建立了NDV激活鸡NLRP3炎症小体的研究体系,为后续的研究奠定了基础。2.NDV感染SPF鸡后NLRP3炎症小体及相关分子的表达本研究首先选取本实验室利用反向遗传系统筛选的强、弱NDV毒株rGM株和IGM株感染SPF鸡,通过qPCR对NDV在体内的复制、促炎性细胞因子IL-1β和IL-18的转录以及NLRP3炎症小体的表达进行分析。结果表明NDV在不同组织中的表达情况与NLRP3炎症小体、IL-1β和IL-18是一致的,具体为rGM组在肺脏、脑和法氏囊中IL-1β、IL-18和NLRP3炎症小体的表达均显著上调,与对照组差异极显著;而在胸腺和脾脏中表达水平均较低。IGM组在肺脏和脑中IL-1β、IL-18和NLRP3炎症小体的表达显示极显著上调,而在法氏囊、胸腺和脾脏中表达水平均较低。3.NDV感染DF-1细胞后NLRP3炎症小体及相关分子的表达本研究为验证NLRP3炎症小体与NDV炎症的关系,运用qPCR方法检测了NDV rGM株感染DF-1后NLRP3炎症小体、IL-1β、IL-18的表达变化。结果显示rGM组感染后IL-1β、IL-18和caspase-1表达显著上调,NLRP3基因上调表达为1.8倍;NDV rGM感染DF-1后可检测到NLRP3的蛋白表达,且表达具有剂量依赖性。使用si-RNA-NLRP3处理细胞后,显著下调caspase-1和IL-1β的转录表达。NLRP3过表达后IL-1β的转录表达显著上调。4.NLRP3炎症小体调控NDV感染引起炎症反应的信号通路初步探索本研究为完善NLRP3炎症小体介导NDV产生的炎症反应的调控机制,对与诱导IL-1β表达相关的S1RP1和NF-κB信号通路进行研究。本研究利用siRNA-NLRP3处理DF-1细胞后用NDV rGM株感染,检测结果显示S1PR1以及P65 mRNA表达水平无显著差异。用S1PR1抑制剂W146处理后用NDV强毒rGM株感染,检测结果显示NLRP3以及P65 mRNA表达水平显著降低。过表达S1PR1处理后用NDV强毒rGM株感染,检测结果显示NLRP3以及P65 m RNA表达水平有明显升高。用si-RNA-P65处理后用NDV强毒rGM株感染,检测结果显示S1PR1的mRNA表达水平无显著差异,然而NLRP3的mRNA表达水平却显示的是明显的降低。因此,初步探索结果表明NDV强毒rGM株感染DF-1细胞后均能激活S1PR1、NF-κB和NLRP3信号通路,且NLRP3炎症小体的调控依赖于NF-κB及S1PR1信号通路。5.NDV诱导的鸡骨髓源树突状细胞(DCs)的炎症反应本研究建立了NDV感染鸡DCs的模型。通过接种NDV rGM株和IGM株,检测鸡DCs上NDV的复制和NLRP3、S1PR1以及P65的转录表达。结果显示NDV在DCs中的增殖情况与其在DF-1细胞中相似,但是NDV感染DCs后S1PR1、NLRP3和P65的转录表达却与DF-1中不同。本研究主要发现了NDV感染禽类后能通过激活NLRP3炎症小体从而促进IL-1β的产生,且可能依赖于NF-κB及S1PR1信号通路的调控。丰富了关于NDV致病机制的研究,为ND的防控以及ND的药物设计提供科学的理论基础。