背景与目的 随着人类基因组序列草图的完成,基因组学研究的广泛开展,基因表达调控研究已经逐渐从单个基因点、线式的调控拓展到立体层面上多基因、基因簇以至整个基因组的调控网络。在遗传调控过程中,反式作用因子与顺式作用元件间的相互作用是构成基因表达调控网络的基础。 核基质附着区(Matrix attachment regions,MARs)是真核生物染色质中可以与核基质(Nuclear matrix,NM)蛋白结合的一段DNA序列。它能使染色质形成环状结构,并与真核基因组中其它调控元件以及反式作用因子一起调节DNA复制、RNA合成和hnRNA加工等过程,在基因表达调控中起重要作用。此外,在基因工程研究中,引入MAR能消除外源基因对整合位点的敏感性,从而消除插入位点周围调控元件的影响,提高转染细胞外源基因表达的效率和稳定性,为克服转基因沉默或基因治疗提供新的途径。目前S/MARtDB库中,人源的MARs仅有117个,其功能尚未全知,而人类基因组中大量的MARs有待深入研究。因此,本研究拟从人基因组中分离随机的MARs元件,构建成随机MARs库;利用体外结合实验筛选出具有MARs特性的序列,并进行测序和相关生物信息学分析,预测人MARs可能具有的功能结构。为进一步探讨MARs在人基因组中的功能意义,深入认识真核生物基因表达调控机制提供新的理论依据。 实验方法 1.随机MARs的分离、克隆与鉴定: (1)MARs的分离与筛选:利用MARs与核基质结合后拮抗高盐和DNA酶作用的特性,从人T细胞株CD3~+-Jurkat细胞中分离MARs。 (2)构建MARs库:将MARs平端化后,构建到PUC19载体上,转化、筛选出阳性克隆。 (3)制备核基质:收集培养细胞,制备细胞核。将细胞核以DNA酶和高盐适当处理,抽提出核基质。