【摘 要】
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生物细胞内的无膜细胞器如核仁、应激颗粒等一般是由相分离导致的凝聚体。凝聚体在细胞内相对独立,其内部分子浓度较高,可保障反应顺利进行且不受干扰。体外构建的凝聚体除了用于细胞器模拟,还可作为微反应器实现特定反应。凝聚体可通过p H、温度、无机盐浓度、聚合物浓度、光照等条件的调控实现解聚。磷脂作为细胞膜的主要组分,其形成的囊泡可作为人造细胞的模型。基于此,本论文以聚赖氨酸（Ply）/ATP凝聚体作为基础
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生物细胞内的无膜细胞器如核仁、应激颗粒等一般是由相分离导致的凝聚体。凝聚体在细胞内相对独立,其内部分子浓度较高,可保障反应顺利进行且不受干扰。体外构建的凝聚体除了用于细胞器模拟,还可作为微反应器实现特定反应。凝聚体可通过p H、温度、无机盐浓度、聚合物浓度、光照等条件的调控实现解聚。磷脂作为细胞膜的主要组分,其形成的囊泡可作为人造细胞的模型。基于此,本论文以聚赖氨酸（Ply）/ATP凝聚体作为基础,通过乳液转移法将其包封进巨型磷脂囊泡（giant unilamellar vesicles,GUVs）中以构建限域微反应体系,采用MgCl2调控GUV内凝聚体的解聚而释放ATP,促进内部肌动蛋白的组装。首先将Ply和ATP以一定配比在室温下混合得到Ply/ATP凝聚体溶液,利用紫外可见光谱法测定,该溶液在550 nm处的透过率,通过荧光显微镜图像观察凝聚体液滴的形态并统计其粒径分布情况,确定了凝聚体在纯水溶液中形成的最佳浓度比为[Ply]:[ATP]=1:3,在p H=8.8的缓冲液中形成的最佳浓度比为[Ply]:[ATP]=4:1。探究了时间和盐溶液浓度对凝聚体稳定性的影响,发现纯水溶液的凝聚体在60 min～180 min内可保持相对稳定,180 min后随时间推移逐渐解聚,至24 h完全解聚。纯水溶液和缓冲液（p H=8.8）中使凝聚体完全解聚的MgCl2浓度分别为20 m M和5 m M。随后在生理环境下通过乳液转移法将Ply/ATP凝聚体液滴包封在GUVs内。通过优化了乳液法的工艺参数,确定其最优反应条件为涡旋时间60 s、ATP浓度为3m M、Ply浓度为12 m M,该条件下包封率可达70%。通过外加蜂毒素的方式在囊泡表面构建纳米微孔,并调节囊泡外MgCl2的浓度使其进入囊泡内部以调控囊泡内凝聚体的解聚。通过原位观察法研究反应过程。荧光显微镜图像表明30 min内可实现囊泡内部凝聚体的解聚。囊泡内部原有的肌动蛋白单体组装成肌动蛋白丝证明了ATP的成功释放。该反应体系实现了限域空间内凝聚体可控解聚释放ATP,表明其可模拟供能人造无膜细胞器。
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