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研究目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球常见恶性肿瘤,最新统计显示其发病率目前居世界第六位,死亡率居第三位。中国是肝癌高发地区之一,其中慢性乙肝病毒感染公认的致癌高危因素。肝癌死亡率居高不下的一大原因是其早期症状隐匿,缺乏特征表现,增加了临床早期诊断的难度,致使多数患者确诊时已至晚期。且最常用的肝癌生物标志物甲胎蛋白对早期肝癌诊断的敏感度有限。因此,目前临床上紧需能够更有效辅助肝癌早期诊断的分子标志物。DNA甲基化是指在DNA上添加一个甲基基团,通常发生在基因启动子区CpG岛,导致基因表达降低或沉默。异常的DNA甲基化与许多人类疾病有关,是包括肝细胞癌在内的多种肿瘤发生的常见表观遗传机制,且研究表明甲基化有作为风险评估和诊断学生物标志物的潜在临床价值。经典Wnt通路在细胞分化、增殖和凋亡中起重要作用。分泌卷曲相关蛋白2（secreted frizzled related protein 2,SFRP2）是SFRP家族重要组成分子之一,可作为拮抗剂参与Wnt信号通路调控。多项研究表明,SFRP2作为抑癌基因,在多种人类恶性肿瘤如结直肠癌、胃癌、食管腺癌、白血病等中通过启动子高甲基化而被沉默。因此,有理由怀疑SFRP2启动子的高甲基化也发生在肝癌患者中,并且有可能作为无创候选分子生物标志物辅助肝癌诊断。本研究主要目的为探讨SFRP2启动子在乙型肝炎病毒相关肝细胞癌患者外周血单个核细胞中的甲基化状态,并评价其作为无创分子标志物对肝细胞癌的辅助诊断价值。研究方法:本研究纳入慢性乙型肝炎相关肝细胞癌（HCC）患者132例,慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）患者 121 例及健康对照者（healthy control,HC）40例进行分析。采用Methylight技术检测外周血单个核细胞中SFRP2启动子甲基化水平。用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测SFRP2的mRNA表达水平。数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析。连续变量以中位数及四分位数间距[M（P25,P75）]表示;分类变量以百分数（%）表示。Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis H检验用于连续变量组间差异分析。SFRP2甲基化水平与临床数据间的关系采用Spearman秩和相关检验进行分析。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）评估SFRP2甲基化水平对慢性乙型肝炎相关肝细胞癌患者的诊断价值。P<0.05认为具有统计学意义。结果:1.HCC、CHB和HC组SFRP2启动子的甲基化水平均以PMR值表示。HCC组患者SFRP2甲基化水平明显高于CHB组患者（P<0.001）和HC组（P<0.001）。CHB组与HC组之间无明显差异。此外,考虑到HCC组SFRP2的PMR与年龄呈正相关,且HCC组平均年龄明显高于CHB组和HC组,为排除混杂因素,采用1:1倾向性评分匹配。HCC及CHB组匹配后,在253例患者中共选取到152例匹配患者（HCC组和CHB组均为n=76）,两组年龄无显著差异（p=0.997）。然后对配对后的两组进行差异分析,HBV相关HCC患者的SFRP2甲基化水平仍显著高于CHB患者（P<0.001）。HCC组和HC组也进行了同样的统计过程。匹配后,共选取64例匹配患者（HCC组和HC组均为n=32）,两组患者在年龄上无明显差异（P=0.930）。匹配后,HCC患者SFRP2启动子甲基化水平仍明显高于HC组（P<0.001）,与匹配前结果一致。2.相对于甲基化水平,我们观察到HCC组SFRP2的mRNA水平明显低于CHB组（P<0.001）和HC组（P=0.016）。CHB组和HC组之间无显著差异。采用Spearman秩相关检验进一步分析SFRP2甲基化水平与mRNA水平的关系,发现SFRP2的PMR值与mRNA表达水平呈显著负相关（Spearman’s r=-0.119,P=0.042）。3.在HCC亚组中,年龄>50岁、女性、HBeAg阴性、HBV-DNA阴性、低分化的患者SFRP2甲基化水平相对于剩余组均显著升高（P<0.05）。采用Spearman秩和相关检验进一步分析SFRP2甲基化水平与年龄、AFP之间的关系,发现SFRP2的PMR值与HCC患者的年龄显著正相关（Spearman’s r=0.365,P<0.001）。但SFRP2甲基化水平与AFP之间无相关性（Spearman’s r=0.144,P=0.099）4.采用受试者工作特征曲线（ROC）评价SFRP2甲基化水平、AFP及二者联合检测的诊断价值,发现SFRP2启动子甲基化水平对应AUC为0.735（95%CI 0.674-0.796）,显著高于 AFP（AUC 0.615,95%CI 0.546-0.685,p=0.013）。选取34.51%的分界点,灵敏度为55.30%,特异性为81.80%。而后建立基于二元logistic回归模型,评价SFRP2启动子甲基化水平与血清AFP联合测定的诊断价值。结果显示联合检测AUC为0.805（95%CI 0.752-0.858）,灵敏度69.70%,特异性78.50%,与单独AFP检测相比诊断效能显著提高（P<0.001）。5.采用多因素logistic回归分析HBV相关肝癌发生的危险因素。按上述34.51%最佳分界点将SFRP2启动子的甲基化水平分为两个亚组,按临床常用的20ng/ml为分界点将AFP水平分为两个亚组。结果显示年龄>50岁（P<0.001）,男性（P<0.010）,SFRP2启动子的PMR值>34.51%（P<0.001）,AFP>20ng/ml（P<0.001）是肝癌发生的独立危险因素。结论:1.慢性乙型肝炎相关肝细胞癌患者外周血单个核细胞中SFRP2基因启动子甲基化水平显著高于慢性乙型肝炎患者和健康受试者。2.肝细胞癌组SFRP2的mRNA表达水平显著低于慢性乙型肝炎组和健康受试者组。且SFRP2甲基化水平与mRNA表达水平呈显著负相关。3.SFRP2启动子的甲基化水平联合血清AFP的诊断效能显著高于AFP独立检测,提示外周血单个核细胞中SFRP2启动子甲基化水平有潜力成为辅助慢性乙肝相关肝癌诊断的无创生物标志物,存在潜在临床应用前景。4.SFRP2甲基化水平在低分化的肝细胞癌患者中明显升高,且SFRP2高甲基化是HCC发生的独立危险因素,提示其用于肝癌监测和预后的可能性。