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性别是一个高度保守的性状，但是不同进化地位的物种控制性别发育的分子机制却不尽相同。哺乳类中有雄性性别决定因子Sry基因(Sex-determiningregion of Y chromosome,Sry)，而在非哺乳类的脊椎动物中却缺少Sry基因。因此，研究非哺乳类动物的性别决定和分化相关基因具有重要意义。黑斑蛙是两栖动物，分布广泛，是研究性别发育分子遗传机制的良好模式动物。 Dmrt1和Sox9基因分别是Dmrt(Double-sex and Mab-3 related transcriptionfactor)和Sox(SRY related HMG-box gene)基因家族的成员。作为参与发育的基因家族，这两个家族在系统进化上高度保守，在胚胎发育分化、组织器官的形成及相关功能的维持、性别决定和分化等中都具有重要的作用。Dmrt1主要表达于脊椎动物成体的精巢中，在所有脊椎动物中对诱导精巢的正常发育起着至关重要的作用。Sox9基因高度保守，参与性别决定，诱导足细胞的发育，而且还参与骨、神经系统和心血管的发育。 为进一步研究Dmrt1基因和Sox9基因，本文采用SMART技术(switchingmechanism at5’end of RNA transcript)获得了黑斑蛙精巢组织双链cDNA。用RACE(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)和RT-PCR(Reversetranscription PCR, RT-PCR)的方法克隆了Dmrt1基因的全长cDNA及Sox9基因的cDNA序列。经过拼接后获得的Dmrt1序列为全长cDNA，由1807个核苷酸组成，其开放阅读框ORF包含1005bp，能编码334个氨基酸；5’UTR(非翻译区)为87bp，3’UTR为712bp。通过BLAST与Genbank上的已知序列进行相似性检索，本文获得的黑斑蛙Dmrt1核苷酸序列与粗皮蛙(Rana rugosa)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)分别具有93％、71％、66％、66％相似性，其推导的氨基酸序列与上述物种具有93％、77％、76％、76％的同源性。通过RT-PCR技术获得黑斑蛙Sox9基因的cDNA序列由1448个核苷酸组成，其开放阅读框ORF含有1446bp，能编码481个氨基酸。通过BLAST与Genbank上的已知序列进行相似性检索比对，发现黑斑蛙Sox9序列与其他物种具有较高的相似性，其核苷酸序列与粗皮蛙，中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)、西方爪蟾(Xenopus tropicalis)、非洲爪蟾、密西西比鳄(Alligator mississippiensis)、人、鼠、鸡(Gallus gallus)分别具有94％、87％、83％、82％、81％、81％、80％、79％的相似性，推导的氨基酸序列与上述物种的一致性分别为96％、93％、91％、90％、85％、80％、81％、84％。ClustalX比对结果也显示这两个基因在动物系统进化上具有较高的保守性。本文研究结果显示，黑斑蛙Dmrt1和Sox9基因在成体黑斑蛙精巢组织中表达。 另外，本文还构建了黑斑蛙精巢组织的cDNA文库。经检测原始文库的滴度分别为2.0×106 pfu/mL和2.4×106 pfu/mL，扩增后的文库滴度为0.48×109pfu/mL和3.0×109 pfu/mL，重组率均在90％以上。其插入片段平均长度约为1.0kb。挑取一阳性克隆分别从5’端和3’端进行测序,得到一长为1170bp的序列。经序列分析知，该序列含有完整的编码框,可编码305个氨基酸，是一全长cDNA序列，提示所建文库是可以用于全长cDNA的筛选。本文所构建的黑斑蛙精巢组织cDNA文库的各项指标均满足建库的基本要求。该文库将为蛙类及两栖类已知的或未知的功能基因及新基因的获得及其研究提供可靠资源；另外，该文库还将为研究蛙类动物的性别决定和分化相关基因及其表达提供直接的分子资料。