论文部分内容阅读
许氏平鲉(Sebastes schlegeli)具有抗病力强，个体大，生长速度快，卵胎生等优势，现已成为我国北方重要的养殖鱼类。然而，对于其性别决定和性腺发育机制了解的还很少。对许氏平鲉性别相关基因的研究，将有助于今后繁殖和育种工作的开展。另外，以卵胎生机制的许氏平鲉为研究对象，也将有利于我们更好地理解鱼类性别决定机制。本研究从性腺分化相关的几个关键基因入手，通过同源克隆和RACE技术获得了许氏平鲉Sox3、Sox9及Dmrt1基因全长cDNA，研究了这3个基因的结构、启动子序列及在成体不同组织和发育时期的时空表达情况。并从表观遗传学水平研究了许氏平鲉Sox3基因启动子区CpG岛甲基化水平与基因表达差异的关系。同时，对许氏平鲉GnRH-I进行了原核表达，通过体内注射研究了这3个基因在未成熟许氏平鲉性腺中的表达变化情况。另外，本文还研究了许氏平鲉在仔鱼发育时期和成体不同组织中内参基因的表达变化，筛选出了合适的内参体系。具体结果总结如下：(1)本研究通过geNorm、NormFinder和Bestkeeper三种不同的软件对许氏平鲉8个候选内参基因(18S rRNA、ACTB、GAPDH、TUBA、RPL17、EF1A、HPRT和B2M)的表达稳定性进行了分析，并在不同组织和仔鱼发育时期筛选出了最优的内参基因：RPL17和EF1A。(2)许氏平鲉Sox3基因cDNA全长1386bp，包括906bp的ORF（301aa），197bp的5’UTR和283bp的3’UTR。编码蛋白含有保守的HMG结构域。多个生物信息学软件分析许氏平鲉Sox3基因启动子区存在多个转录因子结合位点，包括转录激活蛋白AP-1、GATA-3、八聚体结合蛋白Oct-1、叉头框蛋白FOXD3、同源盒基因PBX1、肝细胞核因子HNF4、HNF3β、CCAAT/增强子结合蛋白C/EBP、GATA-1、GATA-3、GATA、核因子NF-1、特化蛋白Sp1、上游刺激因子USF及性别相关蛋白SRY、Sox5、Sox9等结合位点。另外，从分子遗传学水平上分析了许氏平鲉Sox3基因启动子区CpG岛甲基化组织差异模式，可知该基因CpG岛甲基化水平跟组织差异表达量不相关。实时定量PCR显示，许氏平鲉Sox3基因在仔鱼发育时期（出生后1、5、10、15、25、35天）都有不同程度的表达，并呈现出逐渐降低的趋势；在成体性腺中表现出性别两相性差异，即在卵巢中的表达强于精巢。组织切片原位杂交显示该基因的mRNA主要定位于卵巢的卵母细胞和滤泡细胞，在精巢的生殖细胞中也有微量表达。(3)许氏平鲉Sox9基因cDNA全长2039bp，包括1461bp的ORF，336bp的5’UTR和242bp的3’UTR。其编码产物（486aa）含有保守的HMG结构域。生物信息学软件分析Sox9基因启动子区存在很多与Sox3基因启动子共同的转录因子结合位点，如AP-1、GATA-3、Oct-1、 FOXD3及性别相关基因SRY、Sox5、Sox9等蛋白结合位点。实时定量PCR显示，该基因在性腺分化的敏感时期（出生后25-30天）表达量达到较高水平；在成体性腺中显示了性别两相性差异，即在精巢中的表达高于卵巢。组织切片原位杂交显示该基因定位于精巢的生殖细胞和Sertoli细胞，卵巢的卵母细胞和滤泡细胞中。(4)许氏平鲉Dmrt1基因cDNA全长1587bp，包括909bp的ORF，189bp的5’UTR和489bp3’UTR。该基因编码产物（302aa）含有保守的DM结构域和MSM结构域。通过多个生物信息学软件较准确的确定了Dmrt1基因启动子区的转录因子结合位点，包括AP-1、GATA-1、GATA-2、GATA-3、Oct-1、FOXD3、STATx、C/EBPa和GATAx。同Sox9和Sox3基因一样，在Dmrt1启动子中也存在SRY、Sox5和Sox9性别相关蛋白结合位点。实时定量PCR分析显示，许氏平鲉Dmrt1在所有检测的仔鱼发育阶段（出生后1、5、10、15、25、35天）都有表达，且表达量呈现出逐渐降低的趋势；在成体不同组织中，该基因只在性腺中专一表达，且在精巢中的表达量远远高于卵巢。细胞定位显示该基因只存在于精巢和卵巢的生殖细胞中，在体细胞中则不表达。(5)将SsGnRH-I融合蛋白腹腔注射性腺未成熟的许氏平鲉，分析了注射0h、8h、16h、24h、48h后这3个基因在性腺中的表达变化情况。发现注射后24h，Sox9和Dmrt1基因在精巢中的表达水平显著升高，而在卵巢中的表达水平变化不明显。Sox3基因则在许氏平鮋两性性腺中的表达水平均升高，且在卵巢中的变化幅度大于精巢。猜测许氏平鲉GnRH-I也许通过调节性别相关基因Sox3、Sox9及Dmrt1的表达影响性腺的发育。