论文部分内容阅读
目的和意义: HER2/neu 癌基因在许多恶性肿瘤细胞表面均有高表达,其中包括乳腺癌、卵巢癌、直肠癌、胰腺癌及前列腺癌等。已有众多的研究结果证实由 HER2/neu癌基因表达的 p185HER2 是免疫治疗乳腺癌等恶性肿瘤的极佳靶位点。在新确诊的乳腺癌中约有 20-40%患者有 HER2/neu 基因的扩增或过表达。回顾性分析表明此类患者对联合化疗的反应差、复发率高、总的长期生存率低。体外研究及动物体内实验结果证实 p185HER2 在乳腺癌的发病及临床进程中发挥重要作用。p185HER2 特异性单克隆抗体(mAb)对表达 p185HER2 的肿瘤细胞系在体外生长有明显的抑制作用。目前 p185HER2 靶向的人源化的单克隆抗体 Herceptin已成功应用于临床并在 HER2 阳性的乳腺癌患者取得了良好的疗效。 嵌合性 T 细胞受体(chTCR)是一种应用基因工程技术重组的免疫受体,它包括细胞膜外的抗原识别区和细胞膜内的信号传导区两部分。目前最为常用的膜外的抗原识别区为单链免疫球蛋白可变区片段(scFv),即由多肽将 mAb 的重链可变区与轻链可变区相连接而成。scFv 与 mAb 的可变区对相应抗原具有相似的特异性和亲合性。激活细胞的信号传导肽则分别选用 T 细胞受体(TCR)中的ζ 链以及与其有类似作用的 FcεR1γ 链,由此重组而成的嵌合性受体 scFv-ζ/γchTCR 可象 mAb 一样特异性地与相应抗原结合,然后经由信号传导肽激活相应的效应细胞。与天然的 TCR 相比,chTCR 的最大优点是与抗原结合时可不受MHC 的限制。将 chTCR 导入 T 细胞或杂交瘤细胞系中,则所转染的细胞系即具有相应的抗原特异性,并可让该细胞系在受到相应抗原刺激时释放细胞因子、表现出细胞杀伤活性。 4<WP=7>第二军医大学 博士学位论文 中文摘要 本研究期望:1)应用 CD3/ CD28 单抗激活淋巴细胞、CH296 包被和离心转染等,建立一种能将 p185HER2 特异的 chTCR 基因通过逆转录病毒(RV)载体高效转染淋巴细胞的方法。2)研究转染 chTCR 的淋巴细胞能否特异性杀伤表达 p185HER2 的肿瘤细胞。3)比较 ζ 和 γ 信号传导肽在同一 chTCR 结构中发挥信号传导的作用。4)应用逆转录病毒载体将 chTCR 转染小鼠造血干细胞,用转基因造血干细胞移植的受体小鼠在造血重建后,其淋巴细胞是否对相应的肿瘤细胞具有排斥作用。 方法和结果: 将 p185HER2 特异性的 mAb(N29)的 scFv 基因与 ζ 和 γ 信号传导肽基因分别构建入逆转录病毒载体的骨架 pRET6 得到逆转录病毒载体 pRET6 N29γ和pRET6 N29ζ。乒乓转染法将载体转入包装细胞系 PG13、GP+E86 成为稳定、高效的产病毒细胞系,病毒滴度约为 1×106CFU/ml。健康人志愿者静脉血淋巴细胞及小鼠脾脏淋巴细胞经 Ficoll 分离后过尼龙柱去除单核细胞,纯化的淋巴细胞经包被在培养板上的抗 CD3、抗 CD28 单抗活化并加入 IL-2 培养后用于基因转染实验。分别将活化的淋巴细胞和病毒上清加入 CH296 包被的培养板,离心转染。转染效率为 50%-80%,转染后的淋巴细胞经流式细胞分析 CD8+ 、CD4+的 T-细胞分别占 80%和 20%。转基因的淋巴细胞分别与高表达 p185HER2 的肿瘤细胞系 SK-OV-3 及不表达 p185HER2 的 MCF7 共培养,检测培养上清中细胞因子 GM-CSF、TNF-α、IFN-γ的浓度,结果表明转染 chTCR 的淋巴细胞与高表达 p185HER2 的 SK-OV-3 共培养组三种细胞因子浓度显著高于对照组。转染载体 pRET6 N29γ的淋巴细胞在细胞因子释放方面明显优于转染 pRET6 N29ζ者。 将 HER2/neu 基因构建入逆转录病毒载体的骨架 pRET6 得到逆转录病毒载体 pRET6HER2 ,将载体转入包装细胞系 GP+E86 成为稳定、高效的产病毒细胞系,收集病毒上清分别转染小鼠肿瘤细胞系 MCA-205 和 MT-901,转基因细胞系皮下及静脉注射后得到表达人p185HER2的小鼠皮下肿瘤和肺转移瘤模型。 含 pRET6 N29γ和 pRET6 N29ζ病毒上清分别转染小鼠骨髓造血细胞后移植给经ΤΒΙ 9.0 Gy 预处理的同系小鼠,移植后 6 个月时分别经皮下或静脉接种转 5<WP=8>第二军医大学 博士学位论文 中文摘要染 HER2 的同系小鼠肿瘤细胞系 MCA-205/ HER2 和 MT-901/ HER2。结果,小鼠皮下肿瘤 MT-901/ HER2 生长明显较对照组缓慢;在 MCA-205/ HER2 肺转移瘤模型中,肺内肿瘤结节数显著较对照组少。 结论: 1.本研究应用重组 DNA 技术构建的逆转录病毒载体 pRET6 N29γ和 pRET6N29ζ,将逆转录病毒载体 pRET6 N29γ和 pRET6 N29ζ转染经抗 CD3、抗 CD28单抗活化的人或小鼠淋巴细胞后,转基因的淋巴细胞可特异性地识别相应的肿瘤抗原 p185HER2,并通过释放 Th1 类细胞因子 GM-CSF、TNF-α、IFN-γ及CTL 对表达 p185HER2 的肿瘤细胞产生明显的杀伤作用。 2.我们通过不断的改良,应用相应的抗 CD3、抗 CD28 单抗激活人或小鼠淋巴细胞,使淋巴细胞处于最佳的活化状态,随后采用 RetroNectin (CH296)包被的培养板并结合离心转染法,使人淋巴细胞的基因转染效率稳定保持在50%至 60%;小鼠淋巴细胞的基因转染效率稳定在 80%以上。高效的基因?