基于miRNA的芥菜SSR标记开发及miR397功能的初步研究

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芥菜(Brassicajuncea)为十字花科芸薹属植物,是世界各地广泛种植的重要油料作物和蔬菜作物,具有富集多种重金属的特性。微RNA(miRNA)是真核生物中普遍存在的一类小分子非编码RNA,在植物生长发育和逆境胁迫响应中具有重要的调控作用。本研究基于芥菜miRNA序列数据开发了芥菜miRNA-SSR标记,对miR397进行了分子进化分析、表达分析和靶基因全基因组分析,并构建了 miR397过表达载体转化拟南芥。主要研究结果如下:(1)芥菜miRNA-SSR标记开发。利用MISA程序对芥菜miRNA序列和转录组序列进行SSR位点搜索,在芥菜的pri-miRNA和pre-miRNA中分别发现了279个、11个SSR位点,在115228条Unigene中发现了 32987个SSR位点。这些SSR都以单核苷酸重复为主,SSR长度均介于12~19bp之间。利用Primer3.0程序开发SSR引物30513对,从中随机选取26对进行验证,其中6对在11个芥菜品种中具有多态性。上述结果说明,基于miRNA序列开发SSR分子标记是开发芥菜SSR标记的有效途径。(2)芥菜miR397生物信息学与表达特性分析。从miRBase数据库中下载来自68种植物中共143条miR397序列,对其进行多序列比对,构建系统进化树并绘制成熟序列保守性Logo图。结果表明,芥菜miR397在进化上与拟南芥miR397同源关系较近,且成熟序列中的大多数碱基非常保守。psRNATarget软件预测结果显示miR397靶基因主要为漆酶基因。芥菜miR397启动子区中发现存在脱落酸、水杨酸、甲基茉莉酸以及厌氧诱导、节律调控等作用元件。qRT-PCR结果表明在芥菜幼苗根系中miR397表达量高于叶片中的表达量,Cd处理条件下miR397表达水平显著上升,说明miR397参与了芥菜对镉胁迫的响应。(3)芥菜miR397靶基因LAC基因的全基因组分析。将拟南芥LAC基因家族与芥菜转录本数据进行BlastP比对,并结合蛋白质结构域分析鉴定出芥菜57个LAC基因,理化性质分析结果表明大多为亲水性的稳定碱性蛋白,其分子量平均为66.94 kD,系统进化树分析表明可将这些基因聚类为7个亚家族。芥菜LAC蛋白定位于细胞质膜和各种细胞器膜上。利用MEME程序对蛋白保守基序分析发现,芥菜LAC蛋白家族中基本含有1~19基序;GSDS分析表明芥菜LAC基因中的内含子数量为4~15个不等。芥菜LAC启动子区域中含有多个与植物生长发育和逆境胁迫响应相关的ABRE、ARE和ERE等顺式作用元件。(4)芥菜MIR397基因过表达载体构建及其转化拟南芥。构建芥菜miR397过表达载体,利用农杆菌介导法转化拟南芥。通过潮霉素抗性筛选以及PCR分子检测得到转基因植株,经自交传代获得纯合过表达株系。结果表明,过表达miR397的拟南芥的长势(根长和果荚数量)优于野生型;在一定镉浓度范围内,过表达miR397植株可提高拟南芥对镉的耐受性。上述研究结果为进一步揭示芥菜miR397功能奠定了基础。
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