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PGRN是一个多功能蛋白,参与许多重要的生理过程,但目前其作用机制并不清楚,正是如此,赋予这个分子神秘的魅力,吸引着国内外许多科学家长期不懈的研究。有关PGRN的生物学功能的分子机制也是我们实验室长期以来研究的一个重要课题。成熟的PGRN经蛋白酶水解产生Grn多肽,Grn多肽也具有重要的生物学功能,如:GrnD能够促进大鼠星形胶质细胞和人神经胶质瘤细胞的增殖、Gm E能够促进神经细胞轴突的生长、Gm A对人乳腺癌细胞系MDA-MB-468具有非常显著的抑制细胞生长的作用等。近年来研究表明,PGRN不同区域的融合蛋白Atsttrin(1/2F-1/2A-1/2C),与PGRN分子一样,也具有明显的抗炎作用。目前PGRN抗炎的分子机制还不十分清楚。而且,有关PGRN的这些Grn多肽的生物学功能及分子机制也有待于进一步深入研究,为了深入探讨Grn多肽及Atsttrin的功能及其分子机制,本研究首先采用不同的表达系统,对PGRN不同Gm多肽和Atsttrin进行了表达纯化鉴定工作。然后,对所表达的Grn多肽及Atsttrin的功能进行了初步研究和探讨。本课题的具体研究内容包括以下几个部分:(1)构建了用于高效表达Gm多肽的酵母表达载体:对实验室的两套酵母表达系统PichiaPinkrM Expression System和pPIC9K in GS115进行改造进行比较,并对表达载体进行改造,使其更便于应用。本实验通过PCR获得a-factor信号肽及HSA基因序列,然后将信号肽、HSA基因序列、6his标签序列及多克隆酶切位点分别引入初始商业化载体pPink-HC和pPIC9K,成功构建了四种酵母通用表达载体:pPink-HC-a-factor-MCS-6his、pPIC9K-MCS-6his、pPink-HC-a-factor-HSA-GGGGS-MCS-6his 和 pPIC9K-HSA-GGGGS-MCS-6his。(2)以GrnE为例摸索蛋白表达条件和策略:实验通过PCR获得PGRN 8个Gm基因片段,通过酶切连接将Gm E连入上述四个通用表达载体,构建了pPink-HC-a-factor-Grn E-6his、pPIC9K-Grn E-6his、pPink-HC-a-factor-HSA-GGGGS-Grn E-6his 和 pPIC9K-HSA-GGGGS-Gm E-6his 四个表达载体。将表达载体线性化后分别电转入两种酵母感受态细胞Pichia Pink Strain1和GS115中,筛选阳性表达菌株,进行诱导表达。在pPIC9KinGS115系统中创新设计了液筛的方法,缩短了实验周期并节约了抗生素。SDS-PAGE及Western blot对酵母表达上清进行检测,结果显示在两套系统中都成功的表达了 Gm E和HSA-Grn E。两套系统在表达量上没有太大差异,然而PichiaPinkTM Expression System相比pPIC9KinGS115,其操作更为简单,实验周期更短、重组子的筛选更为直观,且不需要昂贵的抗生素筛选。因此,后续实验采用PichiaPinkTM Expression System进行表达。(3)进行PGRN不同Gm片段及其HSA融合蛋白的表达、纯化:将其余 7 个 Gm 片段(GrnP、GrnG、GrnF、GrnB、GrnA、GrnC、GrnD)分别连入 pPink-HC-a-factor-MCS-6his、pPink-HC-a-factor-HSA-GGGGS-MCS-6his表达载体中,进行单表达和融合HSA表达。SDS-PAGE及Western blot结果显示单表达载体系统所表达的蛋白量低或不表达,且存在降解的问题;融合HSA后,蛋白表达量有很大提高,上清中可达到0.5mg/mL。通过Ni-NTA纯化,浓度可达1mg/mL 以上。(4)初步探究PGRN不同Grn片段的功能:将表达纯化的蛋白 HSA、HSA-Grn P、HSA-Grn G、HSA-Grn F、HSA-Gm C、HSA-GrnD、HSA-GrnE、HSA-GrnB、HSA-GrnA,按照终浓度 1Ong/mL 加入到PC12细胞系中,倒置显微镜下观察细胞神经轴突的生长情况,结果显示加入HSA-Grns对于该神经细胞轴突的生长没有作用。(5)PGRN衍生蛋白Atsttrin的表达、纯化及其在小鼠体内实验研究:实验通过overlap PCR获得的Atsttrin基因全长,然后通过酶切连接将Atsttrin基因插入表达载体,成功构建了原核表达载体pRSET-B/Atsttrin。将质粒载体电转入大肠杆菌E.coli BL21(DE3),进行诱导表达,Ni-NTA纯化。SDS-PAGE及Western blot检测,结果显示目的蛋白Atsttrin成功表达,纯化出的目的蛋白条带单一,浓度达2mg/mL。实验建立了小鼠耳朵皮肤炎模型,将纯化的Atsttrin蛋白腹腔注射入小鼠体内,实验结果显示实验组注射蛋白Atsttrin后耳朵厚度明显减小,炎症因子IL-1β、IL-6、COX-2表达水平显著降低。综上所述,实验成功构建了四种酵母通用表达载体,分别在两套酵母表达系统中单表达以及融合HSA表达了G nE片段,结果显示,GrnE在两套系统中均能够正确表达,而从表达时效和操作方面比较,PichiaPinkTM Expression System更优。本研究首次对两套酵母表达系统进行比较评价,以期对应用者提供一些参考价值。后续实验将PGRN其余7个片段分别在该系统中单表达和融合HSA表达,结果发现融合蛋白表达量较高且稳定性较好。对8个融合HSA表达的Grn片段进行大量表达并Ni-NTA纯化,获得了浓度较高、较纯的目的蛋白。该项工作的完成为后续功能的研究及抗体制备奠定了基础。以表达纯化的HSA为阴性对照,在PC12细胞中观察其对细胞轴突生长的作用,初步探究了 PGRN不用片段的活性和功能。另一方面,实验成功构建了 pRSET-B/Atsttrin表达载体,表达纯化Atsttrin目的蛋白。在小鼠耳朵皮肤炎模型中探究了其活性和机理,发现小鼠注射Atsttrin,其耳朵厚度明显减小,炎症因子IL-1β、IL-6、COX-2表达水平显著降低,初步表明表达纯化的蛋白Atsttrin具有抗炎作用,为其分子机制的探究奠定了基础。