内皮细胞特异性高表达CYP2J2对视网膜缺血-再灌注模型导致血管内皮细胞衰老的保护作用研究

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研究背景视网膜缺血-再灌注(retinal ischemia-reperfusion,retinal I/R)模型造成的视网膜I/R损伤,可引起视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)凋亡和血管损害。明显的RGCs凋亡发生在I/R损伤2天后,血管损害则可出现在损伤后不同阶段。例如,I/R损伤2天内出现视网膜血管通透性增加、血管周围炎症细胞浸润及内皮依赖性舒张功能受损等早期血管损害,7天后则开始出现明显的视网膜毛细血管变性。细胞衰老是细胞不可逆地失去分裂增殖能力,但仍保有活性的状态。细胞衰老分为增殖衰老和早熟衰老两类,二者分别由细胞内(细胞增殖次数过多)和细胞外刺激因素(如氧化应激)引起,其中早熟衰老可在损伤后短时间内出现。视网膜I/R损伤可引起组织氧化应激,因此其可能诱发细胞早熟衰老。血管内皮细胞衰老影响血管的结构和功能,导致内皮依赖性的血管舒张功能下降、血管通透性增加及血流灌注减少等病理变化。CYP2J2(cytochrome P450 2J2)是人细胞色素P450表氧化酶家族的成员,可分解细胞膜上花生四烯酸并代谢为血管活性物质环氧化二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs),EETs通过抗炎、抗凋亡多种机制发挥血管保护作用,但尚不能确定CYP2J2和EETs是否能抑制血管内皮细胞衰老。研究目的(1)研究CYP2J2是否对视网膜I/R损伤引起的血管损害和神经节细胞凋亡具有保护作用。(2)研究视网膜I/R损伤引起血管损害和神经节细胞凋亡的机制。(3)研究CYP2J2血管保护作用的分子机制。研究方法1.动物实验(1)使用体重200g左右(约8周)成年雄性野生型(wild type,WT)和内皮细胞特异性高表达CYP2J2的转基因型(transgenic,TG)大鼠进行实验,以视网膜I/R模型作为动物模型,将实验动物分为3组:野生型对照组(WT),野生型缺血-再灌注组(WT+I/R)和转基因型缺血-再灌注组(TG+I/R)。使用免疫荧光染色检测3组大鼠视网膜RGCs数量和金属基质蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9),脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF),衰老相关蛋白p53、p16的表达情况;TUNEL染色检测RGCs及视网膜毛细血管细胞的凋亡情况;PAS染色检测视网膜毛细血管变性程度;β-半乳糖苷酶染色检测视网膜血管内皮细胞的衰老情况。(2)使用体重200g左右(约8周)成年雄性野生型大鼠进行实验,以视网膜I/R模型作为动物模型,将大鼠随机分为3组:对照组(Ctrl),造模组(I/R),造模+硝普钠组(I/R+SNP),其中硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)是一种抗血管内皮细胞衰老药物,在造模前后分别通过腹腔注射的方式给药。使用免疫荧光染色检测各组大鼠视网膜RGCs数量及衰老相关蛋白表达,TUNEL染色检测RGCs及视网膜毛细血管细胞凋亡情况,IB4染色检测视网膜血管密度。2.细胞实验使用过氧化氢(H2O2)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)衰老,分别使用表达绿色荧光蛋白(green fluorescentprotein,GFP)和CYP2J2的腺病毒(Adenovirus,Ad)感染细胞,将细胞分为4组:Ctrl(对照组),H2O2,H2O2+Ad-GFP,H2O2+Ad-CYP2J2。通过蛋白免疫印记检测衰老相关蛋白表达情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老情况,成管实验检测体外血管生成能力。为进一步探究CYP2J2对衰老相关蛋白的调控机制,我们使用实时定量PCR检测各组内皮细胞中mi RNA的表达情况,并在人胚肾293T(HEK293T)细胞中分别过表达和抑制mi R-128-3p的表达,然后使用蛋白免疫印迹法检测衰老相关蛋白表达情况。研究结果与对照组相比,野生型造模组(WT+I/R)RGCs凋亡增加,血管密度降低,毛细血管细胞凋亡增加,血管周细胞数量减少。此外,视网膜I/R损伤也引起血管内皮细胞衰老相关蛋白p53、p16表达增加,MMP-9表达上调,BDNF表达减少,β-半乳糖苷酶染色阳性血管内皮细胞增多。与WT+I/R组相比,CYP2J2转基因鼠造模组(TG+I/R)RGCs和毛细血管细胞凋亡减少,血管密度和周细胞数量增加,p53、p16蛋白表达下调,MMP-9表达减少,BDNF表达增加,β-半乳糖苷酶染色阳性血管内皮细胞减少。以上结果说明内皮特异性过表达CYP2J2抑制I/R损伤引起的RGCs凋亡,血管内皮细胞衰老及血管损害。对比I/R组和I/R+SNP组发现,SNP减少视网膜I/R损伤造成的内皮细胞p53、p16表达上调。与I/R组相比,I/R+SNP组血管密度增加,毛细血管细胞凋亡减少,RGCs凋亡减少。上述结果说明在视网膜I/R模型中,减轻血管内皮细胞衰老可以抑制血管损害,最终减少RGCs凋亡。经H2O2处理的HUVECs细胞p53、p16表达增多,β-半乳糖苷酶活性增加,CYP2J2过表达抑制H2O2诱导的p53、p16上调及β-半乳糖苷酶活性增加。使用实时定量PCR分别检测Ctrl,H2O2,H2O2+Ad-GFP和H2O2+Ad-CYP2J2各组细胞mi RNAs的表达情况,发现H2O2处理后mi R-128-3p表达增多,过表达CYP2J2抑制H2O2诱导的mi R-128-3p表达上调。在HEK293T细胞中过表达mi R-128-3p,导致p53、p16表达上调;反之,抑制mi R-128-3p使p53和p16水平下调。以上结果说明CYP2J2通过mi R-128-3p抑制血管内皮细胞衰老。研究结论视网膜缺血-再灌注损伤导致视网膜血管内皮细胞衰老,衰老的血管内皮细胞引起视网膜血管损害,进而加重神经节细胞凋亡。CYP2J2通过抑制血管内皮细胞衰老减轻其造成的血管损害,进而减少神经节细胞凋亡。
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