猪繁殖与呼吸综合征是一种世界范围的猪病，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。主要引起母猪繁殖障碍和新生仔猪呼吸道症状。病原猪繁殖与呼吸综合征病毒属动脉炎病毒科动脉炎病毒属成员，为正单股RNA病毒。基因组全长15kb左右，含有9个开放式阅读框。不同的PRRSV分离毒株之间存在遗传行、抗原性和致病性的差异。为了研究不同致病性PRRSV分离毒株致病性差异产生的分子机制和2002～2007年PRRSV分离毒株在我国的变异和进化，对本实验室不同时期分离的两株具有不同致病性的PRRSV分离毒株S1和SY0608进行了全基因序列测定和分析；对SY0608毒株在内的34株分离株进行了ORF5基因的分子流行病学研究；建立了检测PRRSV Nsp2基因缺失毒株的RT-PCR检测方法。 猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1毒株是本实验室于1997年从上海发病仔猪体内分离的中等致病力毒株。为了揭示其分子结构特征和与美洲毒株的亲缘关系，本研究对S1毒株进行了全基因序列测定。将S1基因组分成6个大小不等的基因片段进行扩增，其中上游片段的3端和下游片段的5端有部分基因序列重叠。首先应用RT-PCR方法分段扩增出包含PRRSV S1毒株大部分基因组的4条基因大片段，扩增的PCR产物经纯化后分别克隆于pCR-XL-TOPO载体，经鉴定后测序。然后应用RACE方法对包含毒株3和5基因末端的两个片段进行了成功的扩增并克隆于pMD-18T载体进行测序。利用测序序列之间重叠基因序列顺序将这些片断序列进行拼接，获得PRRSV S1株全基因组cDNA序列。测序结果表明，PRRSV S1毒株基因组全长15441 bp，包含8个开放式阅读框，5’端非编码区含有189nt，3’端非编码区舍有181nt，其中包含30nt的Poly (A)。基因组序列分析结果显示，该病毒与美洲型标准毒株ATCC VR-2332和中国早期分离株BJ-4的核苷酸同源性分别99.5％和99.6％。与另一国内分离株CH-1a的核苷酸同源性为90.8‰证明PRRSV S1毒株为美洲型传统毒株。 近年来在华东地区很多养殖场发生了一种严重的猪高热综合征，该病的主要特征是引起各种日龄的猪发热，皮肤发红，呼吸困难，神经症状明显，发病率和死亡率高，对保育猪和育肥猪引起的发病和死亡更高，而哺乳期的小猪发病率则相对较低。从2006年6月到12月，在临床诊断、病理变化观察和RT-PCR检测的基础上共有81个猪场诊断为PRRSV感染。将RT-PCR诊断为PRRSV阳性的病料经组织匀浆和无菌处理，然后接种于长满单层的Marc-145细胞进行病毒分离，结果从6个省市20个发生高热综合征的猪场分离到20株PRRSV分离株。 对其中的6株病毒进行了连续的噬斑纯化，将其中的一株病毒命名为SY0608毒株。SY0608毒株的生物学特性试验、间接免疫荧光试验、电子显微镜观察和RT-PCR鉴别诊断，证明SY0608株为美洲型PRRSV分离株。应用RT-PCR对毒株主要囊膜蛋白基因ORF5和非结构蛋白2(Nsp2)基因进行扩增后克隆至T载体。测序结果显示，ORF5基因和其它5株从高热病病例中分离毒株的核苷酸同源性为99.5％～99.8％，推导的氨基酸序列的同源性为98.2％～100％。但是同美洲标准毒株VR-2332相比，核苷酸同源性为89.4％，推导的氨基酸序列同源性为88.6％。SY0608毒株的非结构蛋白2(Nsp2)基因为2850bp，同VR-2332相比，核苷酸同源性为79.4％，而推导的氨基酸序列同源性为74.9％，在VR-2332 Nsp2蛋白对应的第480和531～559位分别缺失了1和29个氨基酸。用SY0608毒株接种不同日龄的PRRSV抗体阴性生长猪和妊娠后期的母猪。结果表明，SY0608能引起30日龄、65日龄和105日龄的生长猪100％的发病和25％～50％的死亡，接种母猪所产仔猪死产和弱仔数达到94.1‰与S1毒株的致病性相比，SY0608株的致病性明显增强。这些结果显示了一种新的高度变异的高致病性美洲型PRRSV已经在华东地区广泛传播。 为了揭示SY0608致病性增强的分子机制，本研究对高致病性PRRSVSY0608毒株进行全基因序列测定。将SY0608株基因组分成大小不等的8个基因片段进行PCR扩增，每个基因片段和相邻的片断都有部分序列重叠，同时应用RACE方法对基因组的5’末端和3’末端进行扩增。扩增后的PCR产物克隆至pMD-18T载体测序。将测序结果利用片段之间的重叠序列进行拼接，从而获得SY0608毒株全基因序列，并与传统PRRSV S1毒株全基因序列进行比较。结果表明：(1) SY0608毒株基因组全长15336bp，5’非编码区为189nt，3’非编码区为165nt。同S1相比，两个毒株之间的核苷酸同源性只有88.5‰其中ORF1b的同源性最低，其次是ORF5和ORF3。(2)将SY0608的核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其它16株美洲型PRRSV分离株序列进行比较，并应用18株PRRSV殴美型分离株构建系统进化树。同传统毒株S1相比，SY0608在进化树中形成独立的分支，结果也显示，S1和SY0608可能来源于不同祖先VR-2332和P129。(3)将SY0608株的Nsp1～Nsp8、GP2～GP5、M和N蛋白与其它9株代表性毒株进行比较，结果显示，变异部位主要集中于Nsp2、GP3和GP5。(4)SY0608株GP5蛋白26和39位氨基酸之间糖基化位点(NGS)发生了变化，可能导致GP5的抗原性发生变化，并可能与病毒免疫逃选有关。(5)B细胞表位分析显示，SY0608缺失SP8表位和SP7表位的大部分，说明在Nsp2中可能存在病毒复制的非必需区，同时在Nsp2中B细胞表位的缺失能够降低机体对病毒的IgA和IgG应答，从而阻止病毒从组织中的清除。由此推测，PRRSV GP5蛋白糖基化位点的变化和Nsp2蛋白表位的缺失可能是造成病毒致病性增强的原因。 PRRSV欧美型分离株ORF5基因编码的囊膜糖蛋白变异程度很高。美洲型毒株中所观察到的大多数氨基酸替代都集中于靠近N端的高度变异区(26位和39位氨基酸之间)，这种变异也包含了NGS从0到3个的变化，这种变化和病毒的毒力具有一定的相关性。为了研究近5年我国PRRSV GP5的变异程度及可能的抗原性与致病力相关基因特征，本研究应用RT-PCR方法，对从2002～2007年本实验室分离的34株PRRSV分离毒株进行ORF5基因的扩增、测序和分析。结果表明，ORF5基因的高度变异区主要存在于信号肽部位和26～39位氨基酸之间，变异主要表现为NGS位置和数量的变化。12株ORF5基因高度变异株在26～39位氨基酸出现了3个NGS，其它11株ORF5基因高度变异株在该部位出现了2个NGS，但其中的10株44位的NGS缺失。因此我们推测26-39位氨基酸之间NGS的增加或44位NGS的缺失可能是造成病毒毒力增强的原因。系统进化分析显示，38株分离株在系统进化树上形成两个相对独立的亚群，高度变异毒株则全部位于sg(subgroup，sg)1中，ORF5基因高度变异毒株SH02于2002年已经开始出现在我国上海。同时发现在传统毒株和变异毒株之间存在RNA重组现象。研究表明，PRRSV可以通过基因变异和不同病毒分离毒株之间的基因重组进化。因此，加强PRRSV基因变异监测十分必要。 高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒流行堵住Nsp2基因存在90个核苷酸的缺失。为了快速检测Nsp2基因缺失毒株，本研究在对不同PRRSV分离株Nsp2基因核苷酸序列分析的基础上，选择该基因缺失部位上下游相对保守的部位。设计了一对兼并引物和一条基因特异性反转录引物，建立了诊断Nsp2基因缺失毒株的RT-PCR检测方法。传统PRRSV S1毒株和高致病性PRRSV流行株SY0608毒株的PCR扩增片段的大小分别768bp和678 bp，差异大小为90bp。特异性试验和敏感性试验证明该检测方法特异性好，但敏感性相对较低，可用于快速鉴定Nsp2基因缺失毒株和传统PRRSV毒株，从而为PRRSV的防治提供参考意见。 总之，本研究证明了Nsp2基因缺失和GP5蛋白糖基化位点的变化是造成病毒毒力增强的可能原因，而基因变异和RNA重组是导致PRRSV变异和进化的基础，这种变异会导致出现更强毒力的毒株和新型PRRSV。因此，加强我国PRRSV流行毒株基因变异监测十分重要。