家蚕(Bombyx mori)是昆虫纲鳞翅目昆虫,有超过5000年的人工驯养的历史,自古以来就是中国重要的经济动物,也是中国传统文化的重要载体,同时,家蚕还是重要的鳞翅目模式生物,具有重要的研究价值。家蚕是较早完成全基因组测序的生物,而且家蚕已经建立了转基因技术、RNA干扰技术、基因组编辑技术等一系列遗传操作技术。经过几十年的研究,研究人员已经揭示了一系列家蚕基本遗传学问题,例如:性别决定、人工驯化等。但是,绝大多数的家蚕基因功能还未知。面对海量家蚕的功能基因和迫切的产业需求,我们急需一种全新的研究方法来加速家蚕功能基因组研究,加快家蚕功能基因组注释。在人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)完成之后,注释基因组就成为了生物学的中心任务之一。近年来,高通量功能缺失筛选技术已被成功应用于基础生物学研究过程中新基因的功能注释。常用的高通量基因功能缺失筛选平台是基于RNA干扰(RNA interference,RNAi)或者规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)系统来建立的。与CRISPR系统相比,RNA干涉系统存在一些固有缺陷,限制了其应用,例如:脱靶效应、基因功能不完全缺失等。因此,全基因组的CRISPR系统是目前最有效的基因功能缺失筛选工具,已被用来识别必需基因、耐药基因和宿主-病原互作基因等。在本文中,我们利用piggyBac转座子将sgRNA文库稳定整合在家蚕胚胎细胞系(Bombyx mori embryonic cell line,BmE)的基因组上,建立了CRISPR全基因组编辑的筛选平台(BmE genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library,BmEGCKLib),这是首次在家蚕中构建高通量基因功能筛选平台。我们利用这个平台鉴定了家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因,以及BmE细胞系响应生物胁迫(家蚕核型多角体病毒,Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)或者非生物胁迫(高温或低温)的基因。此外,在本研究中,我们应用piggyBac转座子系统替代普遍应用的慢病毒系统来递送CRISPR文库到目标细胞基因组上,为更多生物构建CRISPR全基因组编辑系统提供了新的递送工具。本研究的主要结果和结论如下:1.家蚕细胞转基因敲除系统的构建将CRISPR文库整合到宿主细胞基因组上是构建全基因组CRISPR筛选平台的关键步骤。在人或者小鼠的细胞中,CRISPR文库主要是应用慢病毒系统整合到基因组上。但是,慢病毒载体在昆虫细胞中转基因效率极低,不能满足构建文库的需求。在本文中,我们选择piggyBac转座子系统将CRISPR文库整合到家蚕细胞的基因组上。为了高效地将CRISPR文库整合到家蚕细胞基因组上,我们构建了一个一元载体系统,命名为:pB-CRISPR,该载体包括三个表达框,分别是由Hsp70启动子驱动的Cas9表达框、由U6启动子驱动的sgRNA表达框和由IE2启动子驱动的Zeocin抗性基因表达框。为了验证pB-CRISPR载体在家蚕胚胎细胞系BmE中的基因编辑效率,我们首先以BmE细胞为基础构建了一个稳定表达绿色荧光蛋白(enhance green fluorescence protein,EGFP)的细胞系BmE-Mi-EGFP。我们设计并构建了三个打靶绿色荧光蛋白编码基因EGFP的家蚕细胞转基因敲除载体pB-CRISPR-EGFP-1、pB-CRISPR-EGFP-2、pB-CRISPR-EGFP-3;两个不打靶EGFP的转基因敲除载体pB-CRISPR-NS-1和pB-CRISPR-NS-2作为对照。将这5个转基因敲除载体分别与piggyBac转座酶(piggyBac transposase)表达载体A3-Helper共转染至家蚕BmE-Mi-EGFP细胞系,转染后用含有Zeocin的完全培养基连续培养两个月。荧光显微镜观察显示:三种转染靶向EGFP的sgRNAs的载体(pB-CRISPR-EGFP-1、pB-CRISPR-EGFP-2、pB-CRISPR-EGFP-3)的实验组中几乎所有细胞的绿色荧光都消失了,而两组转染对照载体(pB-CRISPR-NS-1和pB-CRISPR-NS-2)的细胞中绿色荧光几乎保持不变,流式细胞仪分析显示同样的结果。最后,我们通过PCR扩增EGFP基因,并进行T-A克隆,应用Sanger测序法对突变模式进行了检测分析。我们挑选了44个单克隆进行Sanger序列,结果显示:几乎所有的EGFP基因都发生了突变,突变类型以小片段缺失为主。此外,超过70%的突变体发生了移码突变。这些结果表明,pB-CRISPR转基因敲除载体系统可以在BmE细胞中高效地实现基因编辑。2.家蚕BmE细胞全基因组编辑文库的构建为了在BmE细胞中建立全基因组CRISPR筛选文库,我们首先针对家蚕全部蛋白编码基因设计了1,534,227个sgRNAs,然后从中筛选了94,000个sgRNAs在94K基因芯片上合成寡核苷酸文库,筛选标准如下:为了提高移码突变效率,我们尽量选择靶向前三个外显子内并且打靶效率高而脱靶效率低的sgRNAs;最终,每个基因筛选出约6个sgRNAs。随后,从94K芯片中纯化出sgRNAs寡核苷酸文库,将其重组到家蚕细胞转基因敲除骨架载体pB-CRISPR上,构建家蚕全基因组编辑质粒文库,命名为:pB-CRISPR-lib。为了保证pB-CRISPR-lib具有较高的覆盖度和多样性,我们总共构建了大约1×10~8个克隆。最终,每个sgRNA覆盖了大约1000个克隆。之后,通过PCR扩增质粒文库pB-CRISPR-lib的sgRNA区域,并进行深度测序,分析质粒库的覆盖率、准确性和多样性。我们检测到51,431个sgRNAs,覆盖家蚕16198个基因,约占家蚕全部基因总数的97.7%。其中,约72%的sgRNAs的reads数在11–200之间。以上结果表明,我们构建的家蚕全基因组编辑质粒文库具有较高的覆盖度和较好的均匀度。在完成质粒文库的构建后,我们将pB-CRISPR-lib和A3-Helper共转染到家蚕胚胎细胞系(BmE)中,一共转染了150个T-25细胞培养瓶(25 cm~2 flask),每个sgRNA平均转染了大约2,000个细胞。经2个月的Zeocin筛选后,几乎所有细胞都整合了pB-CRISPR-lib系统,构建完成的家蚕全基因组编辑细胞文库,命名为BmEGCKlib(BmE genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library)。随后,我们收集了4×10~7个BmEGCKlib文库的细胞,抽提基因组后测序分析sgRNA丰度。结果显示:BmEGCKlib细胞文库总计包含48,982个sgRNAs,约占pB-CRISPR-lib质粒文库中sgRNA数量的95.2%,相关性分析显示,BmEGCKlib细胞文库与pB-CRISPR-lib质粒文库高度相关,相关性系数为0.99。以上结果表明,我们构建的家蚕全基因组编辑细胞文库可以用于家蚕功能基因筛选。3.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因为了对家蚕的基本功能基因进行注释,我们首先应用家蚕全基因组编辑细胞文库BmEGCKLib鉴定了家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因。我们将构建好的细胞文库BmEGCKLib在27℃的条件下培养,每隔一个月收集一次细胞,每次收集4×10~7个BmEGCKLib文库的细胞,总共收集三次,分别命名为BmE-Lib 1、BmE-Lib 2和BmE-Lib 3。分别抽提三组细胞的基因组DNA,然后通过PCR扩增三组细胞的sgRNA片段进行深度测序。根据测序结果,我们计算了每个时间点的sgRNAs数量和sgRNAs丰度。结果表明,随着时间的推移,BmEGCKlib细胞文库中sgRNA的数量逐渐减少。虽然sgRNAs的总体丰度呈逐渐减少的趋势,但部分sgRNAs明显富集,表明随着培养时间的延长,BmEGCKlib细胞文库受到了筛选。我们利用MAGeCK软件分析家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因。生物学重复实验显示,在基因水平(r=0.76)和sgRNA(r=0.87)水平具有高度可重复性,说明我们的筛选实验数据可信度很高。之后,我们计算了正筛选基因(sgRNA富集)得分和负筛选基因(sgRNA消耗)得分,然后以p-value≤0.05为阈值,总共筛选到1,006个必需基因和838个生长抑制基因。我们还发现,家蚕BmE细胞的必需基因和其他真核生物的必需基因高度重叠,但是和原核生物的必需基因重叠较少。家蚕BmE细胞的必需基因和生长抑制基因几乎都均匀地分布在28对染色体上。结合BmE细胞转录组数据,我们发现,与家蚕所有基因的平均表达水平相比,家蚕BmE细胞必需基因的平均表达水平更高,而BmE细胞生长抑制基因的平均表达水平比家蚕所有基因的平均表达水平低。同时我们对家蚕丝腺细胞的基因表达水平进行了同样的调查,也呈现出相同的规律。家蚕BmE细胞必需基因的基因本体论(Gene Ontology,GO)功能富集分析显示,BmE细胞的必需基因主要与核心细胞成分相关。为了确定家蚕BmE细胞必需基因的生物学功能,我们对家蚕BmE细胞的必需基因进行了KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)富集分析。结果显示,富集程度最高的通路大多与DNA代谢、RNA代谢或者蛋白质代谢相关,如:核糖体、RNA转运、mRNA、剪接体、核糖体生物发生、嘧啶代谢等。此外,我们还对BmE细胞的必需基因和生长抑制基因进行了亚细胞定位分析。结果显示,家蚕BmE细胞的必需基因主要定位于细胞核(~38.2%)和细胞质(~34.4%)。我们还发现,定位于细胞核和线粒体的基因中,必需基因的比例比生长抑制基因要高。4.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因自然环境对生物是至关重要的,环境变化往往会给生物体带来巨大的挑战。为了应对极端环境带来的生存挑战,生物进化出了很多的重要抵抗机制。本部分我们应用家蚕全基因组编辑细胞库筛选了家蚕响应高温或低温胁迫的基因,为研究生物体在高温或低温胁迫下的生理生化反应提供参考。我们将BmEGCKLib细胞文库平均分成三组,每组含有4×10~7个BmEGCKLib文库细胞。其中两组作为实验组,分别在4℃或者30℃培养,另一组作为对照组,在BmE细胞的正常培养温度(27℃)培养。培养20天后,分别收集三个组所有存活的细胞,提取三组细胞的基因组DNA,然后PCR扩增sgRNAs区域,进行深度测序分析,鉴定家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因。之后,我们对筛选到的家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因做了KEGG通路富集,分析这些基因可能的生物学功能。KEGG富集分析显示,4℃存活的细胞正筛选得到的基因(sgRNA富集)主要富集在必需基因的通路,这些通路主要包括RNA相关通路和蛋白质相关通路。此外,负筛选基因在甾体生物合成途径、脂肪酸生物合成通路和脂肪酸代谢通路富集,暗示维持细胞膜的流动性是细胞应对高温或低温胁迫的关键。然后,我们对筛选到的家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因做了亚细胞定位分析。我们发现,在4℃组和30℃组中,细胞膜上的负筛选基因均多于正筛选基因。然而,在4℃和30℃两组细胞中,线粒体上的正筛选基因均多于负筛选基因。这表明生物膜系统更有可能被高温或低温摧毁,降低能量代谢水平可能有助于细胞在极端环境下存活。5.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染基因家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrodrovirus,BmNPV)是对蚕业生产危害最大的病原微生物。在本部分,我们将运用家蚕全基因组编辑细胞库(BmEGCKlib)筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因。我们将家蚕全基因组编辑细胞库(BmEGCKlib)均匀的分成两份,每份包含4×10~7个BmEGCKlib文库细胞。其中一份感染BmNPV(每隔一天感染一次,总共感染4次),然后用流式细胞仪分选出绿色荧光蛋白阴性的少数细胞作为实验组,另一份不感染BmNPV作为对照组。分别收集实验组和对照组的所有存活细胞,提取两组细胞的基因组DNA,然后PCR扩增sgRNAs区域,进行深度测序分析,鉴定家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因。我们总共鉴定到811个正筛选基因和809个负筛选基因。之后,我们对筛选到的基因进行了KEGG通路富集分析,显著富集的通路是:吞噬体、Notch信号通路、Wnt信号通路等。最后,我们选择了三个家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的正筛选基因,构建了三个单基因敲除细胞系来验证我们的筛选结果。与对照相比,三个单基因敲除的细胞系均表现出一定的BmNPV抗性。总结:在本文中,我们首次构建了家蚕全基因组编辑细胞库,然后我们应用家蚕全基因组编辑细胞库筛选鉴定了家蚕BmE细胞的必需基因和生长抑制基因,以及家蚕BmE细胞响应生物胁迫(BmNPV侵染)或者非生物胁迫(高温或低温)的基因。我们的研究结果为家蚕基因组的功能注释提供了一个全新的高通量平台。此外,本研究还为非模式生物全基因组CRISPR筛选提供了可供借鉴的研究策略。