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研究背景与目的食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,我国约90%的食管癌为食管鳞状细胞癌（ESCC）。由于早期症状隐匿、诊断晚、预后差,食管癌已成为威胁人民生命健康的沉重疾病负担。食管癌分布具有明显的地域差异,且环境因素与食管癌的发生发展密切相关。尽管已有广泛的研究,导致某些地区食管癌持续高发的危险因素尚未阐明。亚硝胺是与食管癌相关的最可能的环境致癌物之一。但是,目前亚硝胺致人食管癌的直接证据尚不充分。本研究在分析淮安食管癌高发区人群饮用水及尿液中九种常见亚硝胺暴露特征的基础上,初步探讨亚硝胺暴露与食管癌风险的关系。进而,以人正常食管上皮Het-1A细胞为靶细胞,基于代谢组学技术探讨环境浓度、人体内暴露浓度、基因毒性浓度九种亚硝胺共暴露的毒效应特征,并结合ICR小鼠模型重点探讨低水平亚硝胺共暴露对健康的不良影响。同时,构建N-甲基苄基亚硝胺（NMBA）诱发性大鼠ESCC模型,探讨大鼠ESCC发生发展过程中的动态分子变化特征,系统研究亚硝胺致ESCC发生发展的机制。结合大鼠ESCC模型的研究结果,开展食管癌高发区人群病例对照研究,并筛选关键代谢通路,借助中介效应模型分析候选效应生物标志物与亚硝胺暴露、ESCC发生发展之间的关联性,筛选潜在特异性效应生物标志物,为高发区人群食管癌筛查和防控策略的制订提供科学依据。研究方法1.分别在食管癌发病率较低的南京地区和食管癌高发区淮安地区,各选取5个代表性自来水厂,采集各水厂水源水和出厂水,应用SPE-GC-MS方法分析饮用水中常见九种亚硝胺的分布特征。采集南京地区健康居民尿液样本262例、淮安地区健康居民尿液样本268例,应用SPE-GC-MS方法分析尿液中九种亚硝胺的水平。应用SPE-LC-MS/MS方法分析淮安地区115例健康对照者、89例食管癌前病变[食管炎伴基底细胞增生（RE/BCH）69例、食管异型增生（DYS）20例]患者以及73例ESCC患者尿液中九种亚硝胺暴露水平,通过Logistic回归分析亚硝胺暴露的相关风险。2.以人正常食管上皮Het-1A细胞为靶细胞,采用非靶向代谢组学技术探讨在环境浓度（低浓度组,0.05μg/L）、人体内暴露浓度（中浓度组,20μg/L）、基因毒性浓度（高浓度组,8000μg/L）水平下,饮用水中常见九种亚硝胺共暴露对细胞代谢谱的影响,结合靶向代谢组学技术和传统分子生物学技术对毒效应机制进行体外验证。以ICR雄性小鼠为体内模型,灌胃给予低（0.0075μg/kg）、中（3μg/kg）、高（1200μg/kg）浓度亚硝胺混合溶液,模拟小鼠自由饮用含0.05、20、8000μg/L亚硝胺的饮用水日摄入量,进一步验证低浓度亚硝胺共暴露的毒效应机制。3.以食管亲和性较高的亚硝胺NMBA为受试物,在0.4 mg/kg剂量水平腹腔注射构建诱发性F344大鼠ESCC模型。收集健康对照组和不同食管病变[BCH、轻度异型增生（L-DYS）、中度异型增生（M-DYS）、重度异型增生（S-DYS）、原位癌（CIS）、浸润癌（IC）]组大鼠血清、尿液及组织样本。基于非靶向代谢组学技术探讨NMBA诱导大鼠ESCC发生发展过程中的动态分子变化特征,并通过关键代谢酶及相关蛋白的表达,系统地探讨NMBA暴露致ESCC发生发展的机制。4.收集91例健康对照人群、99例食管癌前病变人群（RE/BCH 60例、DYS 39例）以及51例ESCC患者的血清、尿液样本,研究不同食管病变人群的血清代谢谱动态变化特征,结合大鼠ESCC模型筛选关键代谢通路;进而通过靶向代谢组学技术,检测关键代谢通路上代谢物水平,应用中介效应模型探讨候选效应生物标志物与亚硝胺暴露、ESCC发生发展三者之间的关系,筛选亚硝胺暴露致ESCC的潜在特异性效应生物标志物。主要研究结果1.淮安食管癌高发区人群亚硝胺暴露特征1.1不同地区饮用水中亚硝胺分布特征淮安地区亚硝胺总污染水平高于南京地区（135.14±98.1 vs.68.65±64.9 ng/L,p＜0.01）。六种主要亚硝胺中,5种亚硝胺平均浓度NDPA（34.91±32.7 vs.15.96±19.23 ng/L,p＜0.01）,NDBA（16.47±17.58 vs.5.44±10.95 ng/L,p＜0.01）,NPyr（6.88±8.05 vs.3.1±5.32 ng/L,p＜0.05）,NMor（32.64±53.72 vs.14.6±31.96 ng/L,p＞0.05）和NDEA（36.53±65.31 vs.18.00±37.06ng/L,p＞0.05）以及检出率NDPA（72.5%vs.57.5%）,NDBA（60%vs.25%）,NPyr（50%vs.32.5%）,NMor（42.5%vs.35%）和NDEA（37.5%vs.27.5%）在淮安地区饮用水中较高;而NDMA检出率（35.0%vs.20.0%）和平均水平（3.69±8.58 vs.1.78±5.47 ng/L,p＞0.05）在南京地区饮用水中较高。1.2不同区域人群尿液亚硝胺水平四种亚硝胺在两地区人群尿液中呈现显著性差异。淮安地区人群尿液中NDEA、NDBA、NPip和NDph A的检出率分别为南京地区的2.4（76.49%vs.32.06%）、1.53（29.10%vs.19.08%）、17.8（27.24%vs.1.53%）和4.34（38.06%vs.8.78%）倍,检出浓度分别是南京地区的2.1（1.31±0.81 vs.0.62±1.06 ng/m L,p＜0.01）,1.6（0.26±0.71 vs.0.16±0.35 ng/m L,p＜0.05）,56.0（0.56±1.03 vs.0.01±0.08 ng/m L,p＜0.01）和3.7（0.63±0.94 vs.0.17±0.81 ng/m L,p＜0.01）倍。淮安地区人群尿液亚硝胺总浓度是南京地区的1.8倍（3.54±1.91 vs.1.94±1.85 ng/m L,p＜0.01）。1.3淮安地区人群尿液亚硝胺水平的病例-对照研究与对照组相比,RE/BCH患者尿液中NMEA（median,0.22 vs.0.16 ng/m L）浓度较高;DYS患者尿中NMEA（median,0.43 vs.0.16 ng/m L,p＜0.05）和NDBA（median,0.11 vs.0.07ng/m L,p＜0.05）水平升高;ESCC患者的尿液中NMEA（median,0.26 vs 0.16 ng/m L,p＜0.05）、NDBA（median,0.08 vs 0.07 ng/m L,p＜0.05）、NPyr（median,0.43 vs 0.22 ng/m L,p＜0.05）、NMor（range,N.D.～0.11 ng/m L vs.N.D.）以及总亚硝胺（median,2.61 vs.2.17 ng/m L,p＜0.05）水平均较高,以上提示食管疾病患者尿液亚硝胺水平较高。Logistic回归分析发现,NMEA、NPyr及NDBA暴露均可显著增加ESCC风险（p＜0.05）;NMEA和NDBA还可以显著增加RE/BCH风险（p＜0.05）。2.低剂量亚硝胺共暴露的毒效应研究2.1亚硝胺对食管上皮细胞代谢谱的影响与对照组相比,亚硝胺诱导食管上皮Het-1A细胞代谢谱发生明显偏移,且偏移程度呈现剂量相关性。低剂量亚硝胺的作用下,食管上皮细胞发生了炎症相关的代谢紊乱,即半胱氨酸（Cys）和蛋氨酸（MET）代谢、烟酸（NA）和烟酰胺（NAM）代谢紊乱,提示炎症反应是低浓度亚硝胺共暴露的重要毒效应。2.2亚硝胺诱导食管上皮细胞炎症反应及机制探讨亚硝胺刺激细胞内ROS产生、引起氧化损伤、促进炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达,诱导炎症反应发生。亚硝胺既可以通过Cys和MET代谢,介导组蛋白甲基化（H3K4me3、H3K36me3）,促进炎症反应;还可以通过下调NAD+/NADH,抑制SIRT1介导的NF-кB p65去乙酰化,激活NF-кB信号通路,促进炎性因子释放。2.3亚硝胺共暴露诱导炎症反应的体内机制探讨当前实验条件下,高剂量亚硝胺暴露可诱导小鼠肝脏炎症,但食管组织无明显变化。肝脏组织蛋白免疫印迹结果显示,环境相关剂量的亚硝胺暴露并没有引起组蛋白甲基化水平、乙酰化p65水平以及炎性因子表达的显著变化,但随着剂量的增加,能够清晰地观察到相关指标的变化。3.亚硝胺暴露致大鼠ESCC的代谢组学特征及潜在机制3.1亚硝胺诱发性大鼠ESCC模型的构建大鼠食管组织大体观显示,与对照组相比,第8周以后大鼠食管组织表面逐渐变得粗糙,有不规则的赘生物或白色凸起,或条索状、结节状或者扁平状隆起形成,肉眼可观食管病灶的数目、范围、程度随着时间的推移而逐步进展。病理结果显示,NMBA可诱导大鼠食管从单纯上皮基底细胞增生,进行性不规则增厚,并逐步形成轻、中、重度食管异型增生及乳头状瘤,最终发展成为浸润癌。3.2亚硝胺致大鼠ESCC发生发展过程中血清代谢谱变化亚硝胺诱导大鼠ESCC发生发展过程中血清代谢谱逐渐发生偏移,大鼠食管病变发展至L/M-DYS阶段时体内代谢发生明显变化,至S-DYS阶段时具备了一些与CIS、IC阶段相似的代谢特征,发生了不可逆的变化。在此过程中,脂质代谢、氨基酸代谢均受到影响,其中NA和NAM代谢、鞘脂代谢和色氨酸（TRP）代谢是NMBA诱导大鼠ESCC发生发展过程中的三条关键代谢通路。3.3亚硝胺致大鼠ESCC的调控机制炎症反应伴随NMBA诱导大鼠ESCC发生发展的全过程。NMBA不仅可激活TRP-KYN-NAD途径促进机体NAD+的合成,并通过IDO1/TDO2-KYN-AHR途径激活AHR受体、诱导CYP1A1表达,促进机体炎症反应和肿瘤免疫逃逸。同时,NMBA还可通过“SPHK1-S1P-S1PR1”调控轴放大炎症反应、促进肿瘤逃逸,加速食管上皮恶性转化。4.亚硝胺暴露与人食管癌的关联性分析4.1不同食管病变人群血清代谢谱变化特征与健康对照者相比,RE/BCH、DYS以及ESCC患者血清代谢谱均发生明显变化,但变化程度不同,其中ESCC患者的血清代谢谱变化最显著,主要包括脂质代谢和氨基酸代谢紊乱。综合考虑大鼠ESCC模型结果,鞘脂代谢和TRP代谢可能成为人ESCC发生发展过程中的关键代谢通路。4.2亚硝胺暴露与人食管癌的关联性及中介效应NPyr暴露可显著增加ESCC风险;NMEA暴露可以显著增加RE/BCH、DYS及ESCC风险。血清S1P升高可增加人DYS、ESCC风险,而SPH、TRP能够降低人RE/BCH、DYS、ESCC风险。中介效应分析显示,S1P、5-HTP/TRP（%）在NMEA致RE/BCH及ESCC结局路径上有部分中介效应,TRP在NPyr致ESCC结局路径上有部分中介效应。S1P、TRP、SPH/S1P、DH-S1P四者联合诊断ESCC的AUC、灵敏度、特异性分别为0.90（95%CI 0.85～0.95,p＜0.05）、0.84、0.80,可能成为ESCC的潜在生物标志。初步结论1.食管癌高发区人群亚硝胺暴露水平高于低发区人群。2.NMEA、NDBA和NPyr暴露与ESCC风险正相关,NMEA和NDBA暴露与RE/BCH风险正相关。3.炎性反应是低浓度亚硝胺共暴露的重要毒效应。亚硝胺既可诱导Cys和MET代谢介导组蛋白甲基化上调,促进炎症反应;也可以下调NAD+/NADH比值,抑制SIRT1介导的NF-кB p65去乙酰化,激活NF-кB信号通路,促进炎性因子释放。4.NA和NAM代谢、鞘脂代谢和TRP代谢是NMBA诱导大鼠ESCC发生发展过程中的关键代谢通路,可通过干扰机体能量代谢、炎性微环境以及免疫抑制,促进食管上皮恶性转化。5.TRP代谢以及鞘脂代谢改变是人ESCC的重要代谢特征。6.S1P、TRP、SPH/S1P、DH-S1P可能成为亚硝胺致ESCC的潜在效应生物标志。