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原始生殖细胞(Primordial germ cells,PGCs)是精子和卵子的前体,负责遗传信息的传递,在物种世代繁衍进程中发挥着重要作用。鸡(鸟类)的PGCs在胚胎发育过程中,随着血液不断迁移,最终在生殖嵴中定居,增殖。研究表明异体移植后的鸡PGCs能够归巢至受体生殖嵴并继续发育,这一特性为禽类物种保存和资源保护提供新的材料;在PGCs上进行基因编辑,并通过移植后产生的配子将这些修饰在世代间传递,为转基因动物生产和优良品种育种材料创制提供新的方法。然而,正常情况下,一个鸡胚中最多可分离获取约3000-5000个PGCs,而异体间移植时每个受体鸡胚至少需要5000-10000个细胞,尤其对稀少或者濒危禽类来说,更不可能毁坏原种来获取PGCs,因此体内分离的PGCs远不能满足实际生产需要。目前,由于体外培养体系不完善,使得体外大量扩增PGCs仍有困难,如何大量获取PGCs仍是其有效利用的难题。近年来,已有报道体外诱导ESCs或iPSCs分化形成PGCs,但是效率低,所以需要深入探索影响PGCs形成的重要因子及其作用。研究表明BMP4是哺乳动物PGCs起源的关键因子,利用外源BMP4蛋白在体外能将哺乳动物ESCs(Embryonic stem cells)诱导分化为PGCs。本课题组前期也建立了鸡PGCs的体外BMP4诱导模型,说明BMP4蛋白在PGCs形成过程中起关键作用,但鸡Bmp4基因的功能仍未见报道。基于此,本研究结合基因编辑技术通过构建鸡Bmp4基因的敲除及通过同源重组技术构建过表达载体,设计体内外试验探究Bmp4基因在鸡PGCs形成过程中的具体功能,为后期探究其分子机制及构建Bmp4基因敲除鸡模型奠定基础,也为进一步完善PGCs形成的调控网络提供理论依据。本试验的研究结果如下:(1)Bmp4基因过表达载体构建及活性验证扩增鸡Bmp4基因CDS区,利用同源重组技术将其连接到过表达载体中,构建pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP重组载体。转染DF-1细胞,观察到绿色荧光表达,证明载体已成功转染细胞,通过qRT-PCR检测发现Bmp4表达量极显著高于对照组(5347±1.2,P<0.01),结果显示pCDH-CMV-Bmp4-EF1-copGFP重组载体具有过表达活性,可用于后续试验。(2)Bmp4基因敲除载体构建及活性验证在Bmp4基因外显子区设计3个敲除靶点序列,分别连接到CRISPR/Cas9系统的PGMLV-GM1载体骨架上,构建Bmp4敲除载体Bmp4-sgRNA1、Bmp4-sgRNA2、Bmp4-sgRNA3,慢病毒包裹后转染 DF-1 细胞,T7E1酶切结果显示3个载体均被切成两条带,基因组上已实现Bmp4基因的敲除。同时TA克隆测序检测结果显示转染敲除载体后基因组上Bmp4序列存在碱基缺失,初步统计敲除效率分别为6.25%、12.5%、18.75%。因此,选用敲除效率最高的Bmp4-sgRNA3载体用于后续试验。(3)体外Bmp4基因功能验证体外分离培养鸡ESCs,随后分6组处理:Control组(自分化)、sg3组(转染Bmp4敲除载体)、BMP4组(添加BMP4蛋白)、OE组(转染Bmp4过表达载体)、sg3+OE组(转染敲除载体后再转染过表达载体)、sg3+BMP4组(转染敲除载体后进行BMP4蛋白诱导)。处理后观察细胞形态变化,结果显示OE组和BMP4组细胞发生分化,4d时有类胚体出现,6d时类胚体增大且数目变多;sg3和Control组无类胚体形成;sg3+OE组4d时有类胚体出现,sg3+BMP4组4d时无类胚体出现,而6d时两组均有少量类胚体。6d时qRT-PCR检测PGCs形成与分化及迁移关键基因的表达变化,结果显示,与Control组相比,OE组Bmp4(9.85±0.2)、Cvh(6.09±0.2)、C-kit(10.20±0.15)及迁移基因 Cxcr4(14.60±0.2)及 BMP4 组Bmp4(7.41 ± 0.1)、Cvh(7.02±0.24)、C-kit(7.88±0.05)、Cxcr4(14.07±0.2)基因表达量均极显著升高(P<0.01);sg3组相关基因的表达量Bmp4(0.52±0.08)、Cvh(0.55±0.08)、C-kit(0.50±0.07)、Cxcr4(0.61 ±0.09)显著下降(P<0.5)。sg3+OE 组 Bmp4(2.88±0.05)、Cvh(2.69±0.2)、C-kit(3.19±0.1)、Cxcr4(4.91±0.1)和sg3+BMP4组Bmp4(1.98±0.1)、Cvh(2.19±0.3)、C-kit(2.47±0.04)、Cxcr4(4.19±0.26)表达量显著升高(P<0.5)。6d时流式检测Cvh阳性细胞率,OE组和BMP4组分别为15.0%±0.12和14.5%±0.10,极显著高于对照组(P<0.01);sg3组阳性率仅为4.79%±0.01,与对照组差异不显著;sg3+OE组和sg3+BMP4组分别为7.41%±0.23、8.66%±0.19,均显著高于对照组(P<0.5)。间接免疫荧光结果与流式结果一致。以上结果均说明Bmp4基因在体外能促进鸡PGCs形成。(4)体内Bmp4基因功能验证鸡胚发育2.5d时分6组进行血管注射:Control组(空白对照)、sg3组(注射Bmp4敲除载体)、BMP4组(注射BMP4蛋白)、OE组(注射Bmp4过表达载体)、sg3+OE组(同时注射敲除和过表达载体)、sg3+BMP4组(同时注射敲除载体和BMP4蛋白)。孵化至4.5d时观察鸡胚发育情况,结果显示sg3组鸡胚小于对照组;sg3+OE和sg3+BMP4组鸡胚均比对照组大,但小于OE和BMP4组。qRT-PCR检测PGCs形成及迁移关键基因的表达变化,结果显示OE组Bmp4(4.48±0.09)、Cvh(4.71±0.1)、C-kit(4.20±0.2)及迁移基因 Cxcr4(4.76±0.22)和 BMP4 组Bmp4(3.39±0.08)、Cvh(4.36±0.13)、C-kit(4.53±0.11)、Cxcr4(5.56±0.2)与对照组相比基因表达量均极显著上调(P<0.01);sg3 组 Bmp4(0.32±0.01)、Cvh(0.38±0.01)、C-kit(0.38±0.08)、Cxcr4(0.33±0.09)相关基因表达量与对照组相比显著下调(P<0.5);sg3+OE 组 Bmp4(1.67±0.1)、Cvh(1.53±0.2)、C-kit(1.35±0.05)、Cxcr4(1.93±0.12)和sg3+BMP4 组 Bmp4(1.69±0.09)、Cvh1.48±0.2)、C-kit(1.21±0.1)、Cxcr4(1.87±0.13)基因表达量与对照组相比均显著上调(P<0.5)。流式检测结果显示,OE组和BMP4组Cvh基因阳性细胞率与对照组相比极显著升高(35.0%±0.10、32.5%±0.11,P<0.01);sg3组阳性细胞率与对照组相比显著降低(5.24%±0.10,P<0.5);sg3+OE组(15.31%±0.21)和sg3+BMP4组(17.43%±0.30)阳性细胞率均显著高于对照组(P<0.5)。WB检测结果显示sg3组BMP4蛋白表达量减少;sg3+OE和sg3+BMP4组BMP4蛋白表达量均比对照组增多,但少于OE组和BMP4组蛋白表达量。体内外功能验证结果均证明Bmp4基因促进PGCs的形成。