论文部分内容阅读
我国是毛兔产销大国,随着兔毛纺织技术的革新,生活水平的提高,目前约60%-70%兔毛用于国内市场需求,国内市场对其需求量越来越大。深入了解毛兔毛囊发育的控制因素,对我国毛兔产业的发展具有重要意义。毛囊是毛兔兔毛生长发育的基础,对兔毛的生长具有调控作用。研究发现有一些细胞因子可以调控毛发生长,如胰岛素生长因子-1(Insulion-Like Growth Factor-1,IGF-1)和表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF),但其对毛兔毛囊发育的调节作用有待进一步研究。基于此,我们通过体外分离培养毛兔毛囊器官,确定毛兔毛囊最适培养环境,并利用毛囊器官,选出EGF与IGF-1联合使用的最佳培养浓度。然后皮下注射IGF-1与EGF联合因子,观察联合因子对毛囊发生、生长的影响,以期为毛兔毛囊发育提供理论基础,助力我国毛兔产业的发展。1、不同体外培养条件对毛兔毛囊体外培养的影响采集毛兔触须毛囊,分离多余组织和脂肪,保留完整毛囊,构建触须毛囊器官培养模型,分别利用Williams E、DMEM、MEM三种不同培养基进行培养,结果发现Williams E和MEM培养基分别培养的毛囊在第2天与第4天时,毛囊生长速度极显著大于第6天(P<0.01),而DMEM组显著大于第六天(P<0.05)。在第2天和第6天Williams和DMEM组生长速度显著大于MEM组,第4天Williams组生长速度显著大于DMEM和MEM组。整个体外培养周期中,WilliamsE组在3组中生长最快,平均生长速度显著高于DMEM和MEM组(P<0.05)。毛囊HE染色结果显示3组毛囊结构存在差异,Williams E组和DMEM毛囊结构完整清晰无明显差异,而MEM组毛囊开始萎缩,内根鞘向前方移动,并且与外根鞘分离,毛囊变得相对较短圆。进一步利用PCNA免疫荧光染色发现,PCNA在Williams E组的毛乳头部阳性表达清晰可见,阳性表达明显高于DMEM组和MEM组,DMEM组仅有毛囊外根鞘有微弱表达,MEM组基部基本无明显表达,说明Williams E组的毛囊增殖能力最强。以上结果表明,与其他两组相比,Williams E培养基更适合毛兔毛囊体外生长。2、IGF-1与EGF因子对毛兔毛囊体外生长的影响设置不同浓度的IGF-1因子和EGF因子,对照组不加因子,利用CCK-8检测毛乳头细胞的增殖能力,筛选IGF-1与EGF因子单独使用的最适浓度,结果发现IGF-1在浓度为10 ng/mL时毛乳头细胞增殖最快,EGF在浓度20 ng/mL时毛乳头细胞增殖最快,进一步发现2种因子联合使用(10 ng/mLIGF-1+20 ng/mL EGF)的效果极显著高于因子单独使用(P<0.01)。根据以上结果,将联合因子加入体外毛囊培养基中,并设置对照组,发现联合因子组毛囊毛发生长长度高于对照组(P<0.05)。生长速率结果表明,联合因子组与对照组在第4天差异显著(P<0.05),两组毛囊在第4天生长速度极显著大于第6天(P<0.01)。加入IGF-1和EGF因子后刺激毛囊生长作用与对照组相比更明显。培养4天后毛囊HE染色发现两组结构均保持完整性,无明显区别。利用PCNA免疫荧光染色发现,培养四天的两组毛囊毛球部均有PCNA表达,但联合因子组毛乳头外表达更强,说明联合因子组的毛囊增殖能力强,与对照组相比,更能促进毛发生长。因此,兔毛囊体外培养可优先考虑在基础培养液中联合添加IGF-1和EGF,这两种因子浓度分别为10 ng/mL IGF-1、20ng/mLEGF。3、IGF-1与EGF因子联用对毛兔毛发生长的影响为了进一步分析IGF-1与EGF因子联用对毛兔毛发生长的影响,进行了毛兔活体注射实验。联用因子组从第8天毛兔毛发开始出现,对照组第10天毛发开始出现,对照组比联合因子组明显延迟,说明联合因子处理组毛兔背部进入毛发开始出现的时间早于对照组。HE染色结果显示在同一处理时期,与联合因子组相比,对照组毛囊密度更为稀疏。进一步检测两组在不同处理时期皮肤组织中毛囊发育相关基因表达量(LEF1、IGF-1、CCND1、WINT2、EGF、IGF-1和FGF2),结果发现处理后第7天,联合因子处理组LEF1和WINT2的表达水平极显著高于对照组(P<0.01),IGF-1和EGF的表达水平显著高于对照组(P<0.05),其他基因的表达水平不显著(P>0.05)。在处理后第14天,联合因子组CCND1、WINT2、IGF-1的表达水平极显著高于对照组(P<0.01),LEF1和EGF显著高于对照组(P<0.05)。当处理第21天时,两组毛发生长均覆盖表皮,联合因子组只有LEF1和EGF显著大于对照组(P<0.05)。当毛囊形成时在7、14天PCNA开始表达于毛囊,实验第21天对照组仅表达于毛囊毛乳头,而联合因子组在毛囊外根鞘、毛乳头均有表达,且明显高于对照组。这说明IGF-1和EGF联合使用对毛兔毛发的生长有促进作用。可将IGF-1和EGF因子作为促进毛发生长的参考。