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奶牛乳腺炎（Bovine mastitis）是由多种细菌引起的乳房内感染,严重影响奶牛产业发展。牛乳中外泌体（Exosomes,Exos）是细胞间信息传递与物质交流的重要参与者,通常被认为来自于奶牛的乳腺上皮细胞（Mammary epithelial cell,MEC）。MEC是乳腺组织最主要的结构细胞,构成了乳腺组织的“微环境”。巨噬细胞在乳腺先天免疫中起到重要作用,其对组织内微环境因子作出反应,可分化成M1型（典型激活）巨噬细胞,起促炎作用,或M2型（交替激活）巨噬细胞,与组织重塑和抗炎反应有密切联系。本研究拟对奶牛乳腺炎症过程中,乳腺上皮细胞是否通过释放外泌体介导巨噬细胞极化过程,从而对奶牛乳腺炎症反应的进程产生影响进行初步研究。本研究利用差速超速离心法富集纯化牛乳和奶牛乳腺上皮细胞系（MAC-T）来源的外泌体,通过纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）、透射电镜（Transmission electron microscope,TEM）、蛋白免疫印迹试验（Western blot,WB）鉴定外泌体;PKH67标记外泌体双层脂质膜,荧光示踪法检测外泌体能否被巨噬细胞（Raw264.7）内化;逆转录-聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）、酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）法检测不同来源外泌体作用于巨噬细胞后促炎性细胞因子、抗炎性细胞因子m RNA水平及受体蛋白水平的变化,结果如下:炎性乳样的鉴定与乳腺炎细胞模型的建立:无菌采集10份牛乳样品,经鉴定其中4份样品的体细胞数（Somatic cell count,SCC）＜200,000个/m L,作为正常对照组;3份样品SCC介于200,000-2,000,000个/m L之间,作为低体细胞数乳腺炎组;其余3份样品的SCC＞2,000,000个/m L,作为高体细胞数乳腺炎组;通过细菌纯化培养、16S r DNA比对测序分析,结果表明,其中4份SCC＞200,000个/m L的样品被不同细菌感染,且均为革兰氏阴性菌。20μL/m L和100μL/m L LPS分别处理MAC-T细胞,RT-PCR结果显示:与对照组相比,两种不同剂量LPS处理组使MAC-T细胞肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）和白介素-6（Interleukin-6,IL-6）m RNA的水平都显著升高,表明细胞水平乳腺炎模型建立成功。牛乳和奶牛乳腺上皮细胞来源外泌体的分离和鉴定:超速离心法分离牛乳及MAC-T细胞培养上清液中的外泌体,NTA检测到离心组分粒径范围在30-150 nm之间;TEM观测到离心组分具有双层膜和典型的“杯盘”样结构;WB检测结果显示,离心组分特异性表达外泌体标志性蛋白CD63、TSG101,以上结果表明,本试验成功富集纯化得到牛乳及MAC-T细胞来源外泌体。体外试验验证外泌体对炎症反应的影响:炎性外泌体与Raw264.7细胞共培养后,RT-PCR检测结果表明,与对照组相比,炎性外泌体使Raw264.7细胞高表达促炎性细胞因子TNF-α、IL-6和白介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）,而正常外泌体处理组能显著抑制这些促炎性细胞因子m RNA的表达,提示乳腺炎症时乳腺上皮细胞来源的外泌体对巨噬细胞介导的炎症反应有促进作用,而正常外泌体有抗炎作用。受体细胞内化外泌体的检测:PKH67荧光标记牛乳及MAT-C细胞来源外泌体,与Raw264.7细胞共同培养,荧光示踪结果表明,不同来源的外泌体均能被Raw264.7细胞所内化。外泌体介导巨噬细胞极化对奶牛乳腺炎症反应的影响:与对照组相比,炎性牛乳以及炎性MAC-T细胞来源的外泌体与Raw264.7细胞共培养后,促炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的m RNA和蛋白水平均显著上升,一氧化氮合酶（Inducible NOS,i NOS）和巨噬细胞甘露糖受体CD206蛋白表达显著升高,抗炎性细胞因子白介素-10（Interleukin-10,IL-10）和转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）的m RNA和蛋白水平下降,精氨酸酶-1（Arginase-1,Arg-1）m RNA表达水平下降,而正常牛乳以及正常MAC-T细胞来源的外泌体处理组结果与之相反。以上结果表明,乳腺组织的结构性细胞——乳腺上皮细胞在乳腺炎症反应过程中,通过外泌体介导巨噬细胞向M1型极化,高表达促炎性细胞因子,促进炎症反应,炎症反应在感染的初期有利于病原微生物的清除,但持续的炎症反应将导致组织损伤,并造成炎症因子风暴等更为严重的后果,而乳腺健康状态下分泌的外泌体能介导巨噬细胞向M2型极化,表达高水平的抗炎性细胞因子,参与机体免疫调节,有一定的抗炎作用。本试验结果为组织结构性细胞对免疫细胞功能的影响提供实例验证,以巨噬细胞为靶点为奶牛乳腺炎的防治提供初步的理论依据。