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目的:脓毒症是由感染导致宿主免疫失调而引起的致命的器官功能障碍。严重脓毒症可能造成多器官功能障碍,而肺功能障碍会导致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)或进展为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)。脓毒症治疗手段主要依靠抗感染、器官支持等,并且目前没有特定的治疗药物被批准用于治疗脓毒症。脓毒症继发ARDS的机制主要是促炎抗炎反应失衡,包括促炎细胞因子等的释放,刺激细胞内相应的信号转导系统,诱导细胞凋亡,从而加重ARDS。而巨噬细胞的极化在调节炎症失衡中发挥重要作用。巨噬细胞可以分化成M1型和M2型,其中M1型可分泌大量促炎因子,如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6),产生促炎作用,发挥机体免疫功能;M2型可分泌抗炎因子,如白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)、精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1),参与组织修复与愈合。根据不同的影响因素,可以调节M1/M2型巨噬细胞相互转化,而巨噬细胞的极化情况决定了炎症的结果。已有研究表明,外泌体能降低肺毛细血管的通透性,抑制炎症反应,减少氧化应激损伤,减轻肺损伤的严重程度,提高脓毒症致ARDS小鼠的生存率。此外,脐间充质干细胞能促进心肌组织内巨噬细胞向M2亚型转化并修复心肌。基于以上认知及已有研究,我们推测骨髓间充质干细胞来源外泌体可能对巨噬细胞的极化有影响,通过加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及外泌体(exosomes)诱导刺激骨髓来源巨噬细胞,对不同时间点巨噬细胞上清液中炎性因子的水平变化进行检测,判断M1/M2型巨噬细胞变化趋势。方法:第一部分:培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞贴壁后换至去除外泌体的培养基培养24-48h后收集收集上清液,采用超速离心法获得外泌体,使用Western Blot对其进行鉴定,BCA蛋白测定法检测其浓度。第二部分:提取并培养小鼠骨髓来源巨噬细胞,将细胞浓度调整至1×10~6/m L,接种于12孔板中。设置PBS对照组、脂多糖(100μg/L)组、脂多糖(100μg/L)+外泌体(10mg/L)组,每组重复3个孔。待细胞贴壁后开始干预,将PBS、脂多糖及外泌体分别同时加入,于干预后6h、12h、24h、48h收集细胞上清液,进行ELISA检测巨噬细胞上清液中TNF-α、IL-6、IL-10、Arg-1的浓度变化。将无菌细胞爬片置于12孔板中,巨噬细胞以1×10~6/m L接种其中,分组方法同上。后经多聚甲醛固定,PBS清洗,Triton-100 X通透,血清封闭,TNF-α及Arg-1抗体孵育,4℃过夜,二抗孵育,PBS清洗,封片,进行免疫荧光检测。结果:1.使用Western Blot,显示表达外泌体特有的膜蛋白标记物CD9及CD63。2.小鼠骨髓来源巨噬细胞贴壁生长,显示细胞分出触角,细胞透亮度较高,成功培养为M0型巨噬细胞。3.经脂多糖刺激诱导后巨噬细胞的形态:细胞呈扁圆形,触角短,透光性较差,为M1型巨噬细胞形态特征。加入外泌体后的巨噬细胞形态:细胞呈索状,触角伸长,透光性较好,为M2型巨噬细胞形态特征。4.ELISA结果:相同时间点,脂多糖组的巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6较对照组及脂多糖+外泌体组水平明显增高。相同时间点,脂多糖+外泌体组巨噬细胞分泌的IL-10及Arg-1较对照组及LPS组水平明显增高。5.免疫荧光:脂多糖组的巨噬细胞TNF-α高表达,脂多糖加外泌体组能显著下调M1型巨噬细胞TNF-α的表达,且能上调M2型巨噬细胞Arg-1蛋白的荧光强度。结论:骨髓间充质来源外泌体,能够抑制M1型巨噬细胞极化,促使巨噬细胞向M2型活化,降低促炎因子产生,促进抗炎因子生成。外泌体能够通过影响巨噬细胞的极化,保持M1/M2型巨噬细胞平衡,使促炎反应向抗炎反应发展,改善炎症反应。