芥子气是一种糜烂性毒剂，杀伤威力强大，素有“毒剂之王”之称。目前，芥子气仍是外军装备的主要毒剂之一，其具有穿透性强、作用持久、防治困难等特点，既可发挥强大的杀伤效能，又可发挥战时防御效果，受到各国军方的普遍关注。 皮肤是芥子气的主要中毒途径，也是其发挥毒性的重要效应器官之一。芥子气染毒后主要造成皮肤的红斑、水肿、起疱、糜烂、坏死等病理变化。迄今为止，尚无芥子气特效抗毒药物，仅采取对症、抗炎等支持疗法，效果并不十分理想。这除了与芥子气自身的毒理学作用特点如多水平、多靶点的特性有关外，还在于对芥子气引起皮肤损伤的分子机制尚不完全了解。但众所周知，芥子气所引起的皮肤损伤的修复和重建归根结底是通过表皮基底细胞的增殖分化来实现的。那么，在小鼠皮肤芥子气染毒之后，对表皮基底细胞特别是表皮干细胞的增殖动力学行为的影响如何，目前尚未见报道。为此，我们开展了本项研究，以期了解芥子气损伤皮肤基底细胞增殖动力学的变化特点，并为从改善干细胞微环境、促进干细胞的增殖分化角度，探索促进芥子气损伤皮肤愈合的新途径以及干细胞移植疗法的建立奠定了基础，具体工作如下： 1．芥子气对小鼠皮肤基底细胞增殖动力学的影响 摘要 本研究采用胰蛋白酶消化法急性分离小鼠耳廓表皮细胞，通过免疫组化及流式细胞术等方法检测证实分离得到的细胞主要是pl整合素阳性细胞，即表皮基底细胞。 采用Pl染色流式细胞术观察了芥子气染毒后小鼠表皮基底细胞增殖周期的时效及量效关系。当染毒浓度为犯mg/mL芥子气时，48h之前细胞周期未发生明显的改变，而染毒后48h出现S及GZ/M期细胞增多的现象;当染毒剂量增至160m留mL及32omg/mL时，在染毒后72h均出现明显的亚二倍体峰即凋亡峰，并呈现出一定的量效、时效关系。 采用Pl并Hoeehst33342双染，激光扫描共聚焦显微镜(Confocal laser seanningmicrosc叩y，CLSM)观察小鼠表皮基底细胞核形态的变化。cLsM显示320m岁mL芥子气染毒后72h，基底细胞核染色质呈高凝集的点状结构并有核碎裂的发生。透射电镜(Transmission eleetron microseope， TEM)观察了不同剂量组(32mg/mL、160mg/mL、咒omg/mL)芥子气染毒后基底细胞的超微结构改变。32mg/mL芥子气染毒后24h可见有典型的凋亡细胞，即出现染色质边集呈新月状，核碎裂等特征性改变;16omg/mL芥子气染毒后24h镜下可见表皮及真皮均有少量凋亡细胞存在。160m留mL及犯Om留mL芥子气染毒72h后可见表皮细胞坏死发生。可见，芥子气染毒后表皮基底细胞的增殖动力学行为发生了改变，可引起表皮基底细胞凋亡，促进细胞的终末分化。结果提示，促进基底细胞的增殖有可能对芥子气皮肤损伤的治疗起着积极的作用。 2.芥子气对小鼠表皮干细胞的影响 本研究利用表皮干细胞具有慢周期性的特点，采取5一澳脱氧尿嚓咤核营(5一bromedcoxytlndine，BrdU)标记滞留术进行表皮干细胞的分离鉴定。技术路线为:10日龄的新生乳鼠耳廓局部透皮给予Brdu(1 omg/mL X 20 p L X3次/d X Zd)，急性分离细胞，经55%乙醇固定、胃蛋白酶消化核提取法变性之后抗体孵育，流式检测。结果显示，小鼠耳廓透皮给予BrdU30天时，实验组阳性细胞率约为6%，可初步认定为表皮干细胞。而小鼠耳廓单次给予spL芥子气(160m留mL)染毒后24h及48h表皮干细胞的数目明显减少。提示通过药物诱导间充质干细胞分化为表皮干细胞从而促进皮肤损伤的愈合可能是值得探索的一个方向。 3.小鼠表皮基底细胞培养条件的初步探索中国人民解方欠月民军事医学科学卫完不页士学位论文2004 摘要 本研究主要采用以下三种方法:组织块培养法、有血清培养法(无滋养层)、有血清培养法(有滋养层)。a.组织块培养法在接种后2天可见表皮基底细胞呈膜状移行生长，细胞呈扁平不规则多角形，彼此紧密相连成单层膜。7天表皮细胞成片生长呈典型的“铺路石”状，并在生长过程中形成特异性的“拉网”现象。b.采用有血清培养液，单纯多聚赖氨酸铺被培养皿，以胰蛋白酶消化法获得的小鼠耳廓表皮基底细胞培养7天后细胞逐渐形成小的克隆。。.有滋养层培养法首先要制备滋养层，具体方式为利用组织块培养法培养的成纤维细胞在半融合状态时经过30Gy(2.5m)60co照射后，换新鲜培养基培养48h后备用。“0C。照射后滋养细胞便失去分裂能力，但仍然生存并有同化营养液的能力，当分离的细胞散落在饲细胞上与之接触后，能促进克隆细胞的生长。但相关实验条件还有待于进一步完善。