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该次研究目的是在体外E-screen实验的基础上加入大鼠肝S9体系,部分模拟体内生理环境,通过对几种已确认为环境雌激素的化学物双酚A(bisphenol A,BPA)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyphthalate,DBP)和对壬酚(nonphenol,NP)、己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)经肝S9作用前后拟雌激素活性变化的研究,来探讨E-screen+肝S9实验用于体外检测环境化学物拟雌激素活性的可行性,扩展环境雌激素体外筛选方法.然后用E-screen+肝S9实验对可疑为环境雌激素的三种拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯的拟雌激素活性进行检测,研究这些农药拟雌激素活性的同时,为这些化学物在生物体内的转化机制和对内分泌干扰作用的研究提供依据.材料与方法:该研究采用化学物促进细胞增殖的一种体外雌激素筛选方法—E-screen实验.选用雌激素受体阳性的人乳腺癌MCF-7细胞株,在实验前两周换成实验用培养基:无酚红的DMEM培养基含10％的去激素血清.实验时将MCF-7细胞以3×10<4>个/ml的密度接种于96孔培养板,每孔200μl,6个平行样,放于37℃,5％CO<,2>/95％空气,相对湿度为95％±5％的培养箱中培养到细胞恢复到对数生长期后,吸弃孔中培养液,向每孔加入180μl新鲜培养基与20μl各种浓度的受试物包括BPA、DBP、NP、DES以及三种拟除虫菊酯类农药氰戊菊酯、氯氰菊酯和甲氰菊酯的混合物,继续培养48h后,向每孔加入5mg/ml四甲基偶氮唑盐3-(4,5-dimethylthiazal-2-yl)2,5-diphenyltetraxoliumbr-omide,MTT)10μl,继续培养4h,吸去孔中液体,每孔加入150μl分析纯二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO),在微量振荡器上振荡15分钟后,在酶标仪上于490nm波长测定吸光度值A.阴性对照为终浓度0.01％的无水乙醇,阳性对照为终浓度10<-9>mol/L的17β-雌二醇(17β-estradiol,E<,2>),各种受试物的终浓度为10<-11>mol/L~10<-6>mol/L.另外将受试物与肝S9体系混合液加入到贴壁生长良好的MCF-7细胞中,观察肝S9作用后的受试物对MCF-7细胞增殖活性的影响.阴性对照为终浓度为0.01％无水乙醇和肝S9的混合物,阳性对照为肝S9与终浓度10<-8>mol/L E<,2>的混合液,各种受试物的终浓度为10<-11>mol/L~10<-6>mol/L.以上两个实验的空白均为不加细胞的空白培养基.均为三次重复实验.将实验数据整理,输入计算机,Excel建立数据库,SAS 6.12软件进行单因素方差分析、t检验及一元线性回归分析.结论:1 肝S9加入培养体系后,不影响MCF-7细胞本身的生长特性.2 加入肝S9后,几种已确认为环境雌激素的化学物拟雌激素活性变化与已知的体内研究结果一致,说明肝S9在该实验体系中起到代谢化学物的作用.3 E-screen+肝S9实验可以作为一种体外实验方法对环境化学物的拟雌激素活性进行检测.4 用E-screen+肝S9实验检测三种农药,氰戊菊酯表现出拟雌激素活性,氯氰菊酯和甲氰菊酯未表现出拟雌激素活性.