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研究背景心肌缺血再灌注损伤（I/R）导致心肌梗死面积扩大,心肌收缩功能受损和再灌注心律失常,长期以来缺乏有效的防治策略,因此需要探究新的方法减少心肌缺血再灌注损伤。铁死亡是一种信号程序调节形式的细胞死亡方式,由于脂质修复酶谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的活性丧失和随后脂质活性氧（ROS）的积累引起。这种铁依赖的细胞死亡在基因、生化和形态上与其他经典的细胞死亡方式不同,与多种疾病的细胞死亡有关。现在研究认为再灌注带来丰富的氧自由基,以及由于心肌细胞死亡导致过量的铁沉积在心肌细胞,从而诱导心肌细胞发生铁死亡。Liproxstatin-1（Lip-1）是一种螺喹恶胺衍生物,近来有研究报道能有效和特异地抑制铁死亡减少肝脏缺血再灌注损伤以及在离体缺血再灌注心脏中的保护作用,但未见在体心脏的研究报道。已有研究表明抑制Nrf2的蛋白表达进而下调GPX4的蛋白表达,从而导致铁死亡。因此本研究主要探讨Lip-1对在体心肌缺血再灌注损伤中Nrf2/GPX4/FTH1/Tf R1信号通路抑制铁死亡的机制。第一章Liproxstatin-1对发生铁死亡的H9c2大鼠心肌细胞的保护作用和机制研究目的1观察铁死亡诱导剂RSL3诱导H9c2大鼠心肌细胞发生铁死亡。2探讨Lip-1能否减少细胞内ROS产生减轻氧化应激、增加FSP1的含量抑制铁死亡保护H9c2大鼠心肌细胞。3探讨Lip-1是否通过影响Nrf2/GPX4的m RNA的表达抑制铁死亡实验方法1使用浓度梯度的RSL3诱导H9c2大鼠心肌细胞,cck8法检细胞活性计算出RSL3对H9c2心肌细胞的半数抑制浓度（IC50）。使用RSL3（IC50）与浓度梯度的Lip-1共处理H9c2心肌细胞,测出Lip-1对H9c2心肌细胞的干预浓度。实验方案采用的分组为:Control组、RSL3组、RSL3+Lip-1组、Lip-1组。2光学显微镜下观察H9c2大鼠心肌细胞形态结构。PI-Hoechst染色观察各组PI阳性细胞的数量,从而验证Lip-1保护H9c2心肌细胞的能力。3流式细胞术检测H9c2大鼠心肌细胞内产生的ROS,验证Lip-1清除脂质过氧化的能力。4免疫荧光检测H9c2大鼠心肌细胞内铁死亡抑制蛋白（FSP1）的含量。5 RT-q PCR检测H9c2大鼠心肌细胞Nrf2、GPX4m RNA的表达水平。结果1浓度梯度RLS3处理细胞12 h,cck8检测出RSL3的IC50为2.165μM,随后测出Lip-1的最佳干预浓度为100 n M,实验分组为Control组、RSL3（2.165μM）组、RSL3（2.165μM）+Lip-1（100 n M）组、Lip-1（100 n M）组。2光镜下观察Control组细胞长势良好,形态呈梭型无皱缩,细胞密度均匀,正常贴壁;RSL3组情况较差,细胞皱缩明显,可见透亮影,正常贴壁细胞数目较少,Lip-1治疗可改善RSL3诱导的细胞铁死亡,Lip-1组小形态特征与Control组无明显变化。PI-Hoechst染色结果显示,与Control组相比,RSL3组PI阳性细胞显著增加（P＜0.0001）;与RSL3组相比,RSL3+Lip-1组PI阳性细胞显著减少（P＜0.0001）。3 Lip-1降低H9c2心肌细胞内ROS的产生,与Control组（0.840±0.199）%相比,RSL3组（37.867±0.252）%ROS含量明显增多（P＜0.0001）;与RSL3组相比,RSL3+Lip-1组（16.700±0.721）%ROS含量显著降低（P＜0.0001）。4 Lip-1升高FSP1抑制RSL3诱导的H9c2心肌细胞铁死亡。5 Lip-1影响Nrf2/GPX4信号通路保护H9c2心肌细胞免受RSL3诱导的铁死亡损害。结论1 Lip-1可以保护H9c2大鼠心肌细胞免受RSL3诱导的铁死亡。2 Lip-1通过减轻细胞内ROS减轻细胞脂质过氧化,增加FSP1的含量抑制铁死亡。3 Lip-1通过升高Nrf2和GPX4的m RNA的表达抑制铁死亡。第二章Liproxstatin-1通过Nrf2/GPX4途径介导的铁死亡减轻在体心肌缺血再灌注损伤的研究目的1探讨Lip-1小鼠在体心肌缺血再灌注损伤的影响。2探讨Lip-1通影响Nrf2/GPX4蛋白的表达抑制铁死亡对心脏I/R的保护作用。实验方法1首先通过伊文思蓝-TTC染色检查评估模型成功,实验分组:Sham组、I/R组、I/R+Lip-1组。总共45只小鼠,每组15只。2通过检查心脏缺血和再灌注时心电图变化,检测心肌损伤标记物LDH、CK-MB评估C57BL/6小鼠心肌损害。3 HE染色、masson染色评估C57BL/6小鼠心脏梗死面积。4超声心动图评估C57BL/6小鼠心功能变化。5 Western blot检测C57BL/6小鼠心肌组织蛋白Nrf2、GPX4、FTH1、Tf R1蛋白的表达结果1伊文思蓝-TTC染色法显示小鼠心脏I/R术后发生心肌梗死增加,说明实验小鼠造模成功。2小鼠心脏左冠状动脉前降支（LAD）结扎10 min心电图表现T波高耸,ST段抬高,QRS波增宽,和T波改变,Lip-1降低ST段高度;小鼠I/R损伤12 h血清中LDH含量升高（P＜0.0001）、CK-MB含量升高（P＜0.001）,Lip-1治疗小鼠血清中LDH含量降低（P＜0.001）、CK-MB含量降低（P＜0.01）。3 HE染色提示小鼠心脏I/R损伤12 h造成缺血部位炎性细胞浸润,心肌细胞肿胀,心肌梗死区域可见局灶性坏死、崩解。Masson染色结果显示小鼠心脏I/R损伤28 d心脏组织中胶原纤维明显增加,呈现纤维化,Lip-1可减少I/R后胶原纤维生成,改善心肌重塑。4超声心动图检查发现I/R损伤3 d的小鼠心功能下降,EF、FS降低,使LVEDd、LVESd升高,Lip-1治疗可改善小鼠心脏左室收缩功能。5 western blot结果显示,小鼠心脏I/R损伤12 h心脏组织蛋白Nrf2、GPX4、FTH1比Sham组降低,Tf R1蛋白比Sham组升高。给予Lip-1治疗后能升高Nrf2、GPX4、FTH1蛋白表达,减低Tf R1蛋白表达。结论Lip-1可能通过升高Nrf2、GPX4、FTH1蛋白表达,减低Tf R1蛋白表达来抑制铁死亡减轻心肌缺血再灌注损伤。