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【目的】脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是一种中枢神经损伤性疾病,造成严重的感觉和运动功能障碍,给患者及家庭带来了沉重的心理及经济负担。脊髓损伤的治疗仍是困扰医学界的难题,寻找有效的治疗策略迫在眉睫。本团队前期研究发现,铁死亡(Ferroptosis)存在于脊髓损伤后的继发性损伤阶段,它的主要特征为铁依赖的脂质过氧化物及脂质活性氧(ROS)的积累,其在形态、生化及基因表达方面不同于坏死、凋亡、自噬等已知的细胞死亡方式。最近研究表明,Liproxstatin-1(Lipro-1)抑制铁死亡的效能强于其他铁死亡抑制剂,例如去铁胺、维生素E及ferrostatin?1。然而,对于Lipro-1修复大鼠脊髓损伤的有效性及机制尚不清楚。本研究旨在探讨Lipro-1修复脊髓损伤的有效性,并寻找其潜在的作用机制,为脊髓损伤的修复提供新的理论依据与治疗策略。【方法】1.体外实验:探讨Lipro-1能否抑制RSL-3诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡(1)实验分组:PBS组、DMSO组、RSL-3组、RSL-3+Lipro-1组、Lipro-1组;(2)检测细胞活性:用浓度梯度的RSL-3处理SH-SY5Y细胞18h,通过CCK8检测细胞活性,并计算RSL-3的IC50;用RSL-3(IC50)与浓度梯度的Lipro-1共处理SH-SY5Y细胞18h,通过CCK8检测细胞活性,筛选Lipro-1的最适干预浓度;(3)PI/Hoechst染色:通过PI/Hoechst染色观察各组PI阳性细胞的数量,从而验证Lipro-1保护细胞的能力;(4)Western blot:通过Western blot检测各组中铁死亡关键调控因子GPX4、5-LOX及ACSL4的表达情况;(5)检测线粒体脂质过氧化及细胞MDA含量:使用线粒体特异性荧光染料Mito Pe DPP及MDA含量检测试剂盒分别检测线粒体的脂质过氧化及细胞MDA含量,来反映Lipro-1清除脂质过氧化的能力。2.体内实验:探讨Lipro-1修复大鼠脊髓损伤的有效性及作用机制(1)实验分组如下:将雌性Wistar大鼠(8周,150g-180g)随机分为3组:假手术(Sham)组、单纯损伤(SCI)组和实验(Lipro-1)组(每组30只)。Sham组仅行T10椎板切除术,不打击脊髓;SCI组和Lipro-1组咬除T10椎板后,使用Impactor Model-III脊髓损伤撞击器制备中度脊髓损伤模型,重锤下落高度为25mm;(2)给药方案:脊髓损伤模型制备成功后,即刻给Lipro-1组的大鼠腹腔注射10mg/kg的Lipro-1溶液,此后每天注射1次直到损伤后第3d。采用同样的给药方式和剂量,给SCI组的大鼠注射生理盐水;(3)行为学评价:术后1d、1w、2w、3w及4w采用BBB评分及斜板试验来评定后肢运动功能的恢复情况;(4)神经电生理检测:术后4w检测感觉诱发电位(Sensory Evoked Potential,SEP)和运动诱发电位(Motor Evoked Potential,MEP)来评价神经功能的恢复情况;(5)Western blot:术后1d、3d用Western blot检测脊髓组织中铁死亡关键蛋白GPX4、Tf、Tf R、FTL、5-LOX及ACSL4的表达情况;(6)ELISA检测:术后2d用ELISA检测脊髓组织中MDA、4-HNE的含量;(7)免疫荧光染色:术后3d、7d用免疫荧光分别检测脊髓组织中Neu N阳性神经元、Olig2阳性少突胶质细胞的存活情况;术后4w通过检测GFAP免疫荧光强度反映星形胶质细胞的活化程度。(8)HE染色及LFB染色:术后4w用HE染色及LFB染色检测组织结构的完整性及脱髓鞘程度。【结果】1.体外实验:Liproxstatin-1抑制RSL-3诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡用浓度梯度的RSL-3处理SH-SY5Y细胞18h,通过CCK8检测细胞活性,并计算出RSL-3的IC50为4.083μM;用RSL-3(4μM)与浓度梯度的Lipro-1共处理SH-SY5Y细胞18h,通过CCK8检测细胞活性,结果显示:Lipro-1的EC50为2.295n M,且当浓度为100n M时,细胞的活性接近100%;光镜下观察细胞形态,RSL-3组(4μM)的细胞皱缩、轴突缩短,而用RSL-3(4μM)与Lipro-1(100n M)共处理细胞时,细胞形态得到显著改善;PI/Hoechst染色结果表明,与DMSO组相比,RSL-3组PI阳性细胞显著增加(P<0.05);与RSL-3组相比,RSL-3+Lipro-1组PI阳性细胞显著减少(P<0.05);Western blot结果显示RSL-3组GPX4的表达显著下降,5-LOX、ACSL4的表达显著上升(P<0.05),Lipro-1处理后GPX4的表达显著上升,5-LOX、ACSL4的表达显著下降(P<0.05);RSL-3组的MDA含量及线粒体脂质过氧化显著上升(P<0.05),Lipro-1治疗后MDA含量下降、线粒体脂质过氧化程度减轻(P<0.05)。2.体内实验:Liproxstatin-1抑制铁死亡修复大鼠脊髓损伤BBB评分及斜板试验表明,相比于SCI组,Lipro-1组大鼠的后肢运动功能恢复较好,差异具有统计学意义(P<0.05);神经电生理检测显示,与SCI组相比,Lipro-1组SEP的潜伏期缩短,差异具有统计学意义(P<0.05);Lipro-1组MEP的振幅较SCI组升高,且差异具有统计学意义(P<0.05);脊髓损伤后,铁死亡负性调控因子GPX4的表达较Sham组下降(P<0.05),而正性调控因子Tf、Tf R、FTL、5-LOX及ACSL4的表达上升(P<0.05),Lipro-1治疗后GPX4表达上升(P<0.05),Tf、Tf R、FTL、5-LOX及ACSL4表达下降(P<0.05);与Sham组相比,SCI组脊髓组织中MDA、4-HNE的含量显著上升(P<0.05),Lipro-1治疗后显著下降(P<0.05);与Sham组相比,SCI组脊髓组织中神经元、少突胶质细胞的数量下降(P<0.05),Lipro-1治疗后神经元、少突胶质细胞的数量显著升高(P<0.05);脊髓损伤后4w,GFAP+星形胶质细胞数量显著升高(P<0.05),Lipro-1治疗后显著下降(P<0.05);HE染色、LFB染色结果显示,Lipro-1可减少脊髓组织的空洞面积及减轻脱髓鞘程度(P<0.05)。【结论】1.Liproxstatin-1通过上调GPX4的表达,下调ACSL4、5-LOX的表达,减轻线粒体脂质过氧化,进而抑制RSL-3诱导的SH-SY5Y细胞铁死亡。2.Liproxstatin-1抑制大鼠脊髓损伤急性期的铁死亡,减轻脂质过氧化,进而保护神经元、少突胶质细胞,减少胶质瘢痕增生,改善大鼠的感觉和运动功能,从而促进脊髓损伤的修复。