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第一部分丙酮酸盐腹腔复苏对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用目的:探讨丙酮酸盐直接腹腔复苏(direct peritoneal resuscitation,DPR)对脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia-reperfusion injury,SCII)大鼠神经功能及组织形态的影响。方法:24只大鼠随机分为4组。假手术组(Sham组)大鼠仅于麻醉后开腹暴露并分离腹主动脉,不进行腹主动脉夹闭和液体腹腔复苏;脊髓缺血再灌注损伤组(SCII组)大鼠麻醉后于右肾动脉上方进行腹主动脉夹闭60min以模拟脊髓缺血再灌注损伤模型;脊髓缺血再灌注组+生理盐水复苏组(SCII+Saline组)大鼠术后于再灌注期间行生理盐水腹腔复苏;脊髓缺血再灌注组+丙酮酸腹腔复苏组(SCII+Pyr-PDS组)术后于再灌注期间行丙酮酸腹腔复苏。分别术后于0/6/12/24/36/48h根据BBB评分法对各组大鼠行后肢功能评分,并于再灌注48h后收集血清检测血肌酐和血尿素氮水平以测定大鼠肾功能并取脊髓组织固定标本行H&E染色及尼氏染色,于光镜下观察染色结果,评估脊髓组织损伤情况及丙酮酸腹腔复苏的保护作用。结果:BBB评分结果显示术后大鼠后肢功能显著降低,且血肌酐和尿素氮结果提示手术未造成肾功能损伤;Saline组大鼠与SCII组大鼠的神经功能恢复没有差异,而丙酮酸腹腔复苏可显著促进脊髓缺血再灌注损伤后大鼠神经功能的恢复,且BBB评分结果显示术后48h丙酮酸腹腔复苏组大鼠后肢功能可恢复接近正常水平;H&E染色结果显示SCII组和SCII+Saline组均有神经元肿胀,灰质和白质边界模糊,在SCII+Pyr-PDS组则均有改善;尼氏染色结果显示无丙酮酸腹腔复苏的大鼠术后均可观察到胞浆内尼氏小体聚集,而丙酮酸腹腔复苏组则有明显改善。结论:于右肾动脉上方利用动脉夹阻断腹主动脉血流1h可成功建立SCII模型且未造成明显的肾损伤;丙酮酸腹腔复苏可以有效恢复SCII所致的神经功能损伤,减轻炎症细胞的浸润和尼氏小体的生成。第二部分自噬在丙酮酸盐腹腔复苏对脊髓缺血再灌注损伤的保护作用中的改变目的:探讨脊髓缺血再灌注损伤(spinal cord ischemia reperfusion injury,SCII)过程中自噬的变化及丙酮酸腹腔复苏(direct peritoneal resuscitation,DPR)对自噬的影响。方法:将36只大鼠随机分为3组,每组12只(9只冰冻标本+3只电镜液固定)。假手术组(Sham组):大鼠仅于麻醉后开腹暴露并分离腹主动脉,不进行动脉夹闭和液体腹腔复苏;脊髓缺血再灌注损伤组(SCII组)大鼠仅于右肾动脉上方进行腹主动脉夹闭;脊髓缺血再灌注组+丙酮酸腹腔复苏组(Pyr-PDS组)术后于再灌注期间行丙酮酸腹腔复苏。各组大鼠于术后48h取材,其中冰冻标本用于q-PCR和western blot检测自噬相关基因和蛋白的表达;电镜液固定标本用于透射电镜观察自噬溶酶体及自噬小体等。结果:q-PCR与Western blot对自噬相关基因和蛋白检测的结果均显示与Sham组相比,SCII可激活自噬,丙酮酸腹腔复苏可进一步上调自噬的强度;此外,透射镜下SCII组可观察到线粒体结构紊乱,部分细胞器及细胞核发生固缩,双层膜结构的自噬溶酶体增多;Pyr-PDS组可见细胞结构的损伤有所减轻,但与SCII组相比自噬溶酶体数量更多。此外我们检测了自噬上游信号通路的表达,q-PCR与Western blot结果显示SCII组PHD2表达降低,丙酮酸腹腔复苏后PHD2表达进一步降低;且HIF-1α/BNIP3 m RNA的表达于损伤后有所升高,其下游自噬抑制基因表达有所下调,丙酮酸腹腔复苏进一步上调了HIF-1α/BNIP3的表达,且与SCII组相比,其下游自噬抑制基因表达进一步下调。结论:脊髓缺血再灌注损伤可激活自噬,丙酮酸腹腔复苏一方面可以有效恢复脊髓缺血再灌注所致神经元微结构损伤的同时可进一步增加自噬强度,其机制可能与调节PHD2/HIF-1α/BNIP3及其下游自噬相关基因的表达相关。第三部分丙酮酸盐对SH-SY5Y细胞系缺氧复氧损伤的保护作用及其机制目的:探讨丙酮酸盐对SH-SY5Y细胞系缺氧复氧损伤(Oxygen-Glucose Deprivation and Reperfusion,OGD/R)的保护作用,以及丙酮酸盐于复氧期间调控自噬变化的机制。方法:SH-SY5Y细胞系分为(1)对照组;(2)OGD组:细胞仅进行缺氧处理,不进行复氧处理;(3)OGD/R组:细胞进行缺氧复氧处理并于复氧0/6/12/24h收集细胞;(4)丙酮酸处理组:细胞于复氧期间给予丙酮酸处理;(5)IOX2组:细胞于复氧期间给予IOX2处理(PHD2抑制剂)。通过CCK-8及流式细胞学验证丙酮酸的细胞保护作用,q-PCR和western blot检测自噬相关基因和蛋白的表达(p62/Beclin-1/LC-3)及其上游信号通路HIF-1α/BNIP3的表达,并观察PHD2随再灌注时间的表达变化。结果:CCK-8及流式细胞学结果均证实了丙酮酸的细胞保护作用,q-PCR与Western blot结果显示OGD/R组PHD2表达降低,丙酮酸处理后PHD表达进一步降低,且HIF-1α/BNIP3 m RNA表达于损伤后有所升高,其下游自噬抑制基因表达下调;丙酮酸处理进一步提高了HIF-1α/BNIP3的表达,且与OGD/R组相比,其下游自噬抑制基因表达进一步下调;PHD2抑制剂IOX2组结果与丙酮酸处理组一致;此外与OGD组相比,OGD/R组的自噬强度有所下调,且随复氧时间的增加,PHD2的表达逐渐上调。结论:随复氧时间的增加,PHD2的表达逐渐上调;而丙酮酸可抑制复氧期间PHD2的活性,降低其对下游HIF-1α的羟化作用,使得HIF-1/BNIP3及下游基因的表达稳定在一个较高的水平。