目的：HIV新发感染检测具有重要的意义。首先，通过识别HIV新发感染可以计算HIV新发感染率，HIV新发感染率表示在一定期间内，特定人群中HIV新发感染病例出现的频率，又称HIV发病率，是评估艾滋病疫情变化趋势、评价艾滋病干预措施有效性、识别高发病率的目标人群并进行有针对性干预的直接依据，计算HIV新发感染率对于艾滋病预防与控制至关重要;其次，HIV感染早期患者病毒载量处于高峰状态，传播风险高于无症状期几十倍，早期发现HIV新发感染者并采取干预措施可有效减少HIV的传播;第三，新发感染者携带的病毒株代表了正在传播的病毒，识别HIV新发感染者有助于明确HIV传播规律的最新动向，促进有效干预并为监测、治疗、预防研究提供早期预警。传统的HIV新发感染判断的金标准是通过队列随访，观察到HIV抗体阴性者在随访过程中发生抗体阳转并获得感染时间，但队列研究需要耗费大量的时间、人力、物力和财力，无法广泛应用。而血清学方法通过检测血清或血浆标本中某些标志物的质和量来判断感染时间，可以采用横断面研究，更为方便易行，其中最具代表性的是BED-捕获酶免疫试验(BED CaptureEnzyme Immunoassay，BED)和限制性抗原亲和力酶免疫试验（Limiting AntigenAvidity Enzyme Immunoassay，LAg-Avidity EIA）两种方法。BED法由于在不同亚型HIV毒株中的平均血清阳转时间(Mean Duration of Recent Infection，MDRI)不一致，受疾病状态等影响较大，在临床中的应用越来越少。取而代之的是LAg-AvidityEIA，研究报道LAg-Avidity EIA方法在不同亚型毒株及人群中MDRI的差异以及受疾病状态等的影响均较BED小，但用于新发感染诊断的敏感度和特异性等仍不够理想。此外，有研究利用HIV在感染者体内快速进化的特点，通过检测感染者体内病毒多态性来判断感染时间，如通过HIV-1 pol区测序得到的混合碱基比例来区分新发感染和长期感染，但此方法容易受多重感染影响。综上，上述每种方法都存在一定的局限性。目前，国内推荐的HIV新发感染首选检测方法是LAg-Avidity EIA。另一方面，我国开展抗病毒治疗及耐药监测已经有十余年的历史，从事HIV疫情监测的实验室常同时拥有HIV基因型耐药检测体系，在以往的耐药监测工作中积累了大量的HIV pol区序列，除评估耐药性外，尚未有效用于的其他用途。我国男男性接触者(Men Who Have Sex with Men，MSM)在HIV新发感染者中构成比逐年增加，其疫情尚未得到有效控制，对于该人群的各种干预措施是否有效降低HIV新发感染率急需通过科学方法评估。本团队前期通过MSM高危人群前瞻性队列随访获得HIV早期感染者系列样本，其感染时间已知。本研究拟以早期感染者队列系列标本已知的感染时间为金标准，探索将HIV-1 LAg-Avidity EIA和序列混合碱基法（Sequence Ambiguity Method，SAM）单独及联合用于MSM人群HIV新发感染判断，明确其诊断效能及具体联合应用方法，以期找到一种能够更好地判断MSM人群HIV新发感染的实验室方法，为我国HIV的监测和控制工作服务。　　方法：⑴从2009-2015年中国医科大学附属第一医院招募的MSM HIV-1早期感染者队列中选取已知感染时间的51例患者的84份血浆样本，其中感染时间在6个月以内的31份，感染时间6个月～1年的23份，感染时间大于1年的30份，标本采集时，感染者均为未接受抗逆转录病毒治疗。所有感染者均签署了知情同意书，本研究并通过了中国医科大学附属第一医院伦理委员会的批准。⑵收集患者EDTA抗凝全血并分离血浆，取140μl血浆，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书，提取60μl的RNA标本，以目前我国HIV耐药检测的标准方案进行巢式PCR反应，扩增病毒pol区(HXB2:2352-3352)1.0Kb片段。第一轮扩增引物为MAW-26:5-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3和RT-21:5-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3，第二轮扩增引物为PRO-1:5-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3和RT-4R:5-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3。⑶第二轮扩增产物送北京六合华大科技股份有限公司进行Sanger测序，正向测序引物PRO-1:5-CAGAGCCAACAGCCCCACCA-3，RT-A:5-GTTGACTCAGATTGGTTGCAC-3和RT-B:5-CCTAGTATAAACAATGAGACAC-3，反向测序引物为ProC1-down:5-CCCTGCTGGGTGTGGTATTCC-3和RT4R:5-CTTCTGTATATCATTGACAGTCCAGCT-3。测得序列通过VectorNTI8.0软件包中的Contig Express组件进行拼接。利用Sequencher5.4软件进行序列混合碱基判读，每一个碱基位置峰图满足下列任意一个条件，被判读为混合碱基:正反向序列都清晰包含次级峰，并且次峰高度均超过局部噪音峰高度的两倍;只有单向序列片段包含次级峰，且次级峰高度为主峰高度30％以上，并且为三倍局部噪音峰高度。⑷按照Maxim HIV-1 LAg-Avidity EIA试剂盒说明书，进行LAg-Avidity EIA的初筛和确证试验。每次试验均需设置2个阴性对照，3个弱阳性对照，3个强阳性对照以及3个校准孔，且对照品和校准品的吸光度值（Optical Density，OD）中位数均应在试剂盒要求的范围内，否则试验结果不可信，应重复试验。用每个对照品的OD值中位数除以校准品的OD值中位数即得到每个对照品的标准吸光度值（Normalized Optical Density，ODn）。初筛试验中每个样品不设平行孔，用每个样品的OD值除以校准品的OD值即为每个样品的ODn值，按照试剂盒要求，ODn值大于2.0的样本直接判定为长期感染，小于等于2.0的样本需要做确证试验，即和初筛试验相同的三次平行试验，确证试验中每个样本的ODn值等于样本的OD值中位数除以校准品的OD值中位数，ODn值大于1.5的判断为长期感染，小于等于1.5的判断为新发感染。⑸利用SPSS19.0软件绘制受试者工作特征曲线(Receiver OperatorCharacteristic Curve，ROC curve)，计算每一种方法的敏感度和特异性及最适临界值。通过二元Logistic回归分析构建LAg-Avidity EIA和SAM联合用于MSM人群HIV新发感染判断的模型。　　结果：①LAg-Avidity EIA用于MSM HIV新发感染判断的MDRI:本研究首先按照试剂盒推荐的ODn临界值1.5，将样本分为ODn值大于1.5的长期感染组和小于等于1.5的新发感染组，并将两组判读结果分别标记为0和1，然后将每份标本的判读结果及其对应的由“金标准”即队列随访得到的感染天数导入SPSS，绘制ROC曲线图，ROC曲线的横纵坐标分别为（1-特异性）和敏感度，得到ROC曲线下的面积为0.855（95％可信区间:0.775-0.935），标准误为0.041，P＜0.01。当约登指数达到最大时，敏感度和特异性分别为76.4％和86.2％，假阳性率即假近期感染率（False Recent Rate，FRR）为13.8％，假阴性率为23.6％。此时对应的MDRI为222天，明显长于试剂盒推荐的小于6个月的MDRI。②LAg-Avidity EIA用于MSM HIV新发感染判断的优化:通过对本研究中几个有不同时段随访标本的研究对象研究发现，同一个体ODn值随感染时间延长有上升的趋势。在感染的前两年，ODn值随感染时间延长几乎呈直线上升，r2和P值分别为300446(r2=0.959, P=0.130),320005(r2=0.774, P=0.315),320237(r2=0.955,P=0.136),320336(r2=0.998, P=0.031),320669(r2=0.935, P=0.164),320745(r2=0.997,P=0.035)。基于样本ODn值随感染时间延长呈上升的趋势，以及新发感染率一般是于每年年底通过一年内的新发感染人数来计算，因此本研究将MDRI设定为一年，计算LAg-Avidity EIA用于MSM人群HIV新发感染诊断的效能及最佳ODn临界值。通过金标准即队列随访将所有样本分为感染时间大于一年和小于等于一年的两组，并将两组判读结果分别标记为0和1，将每份标本的判读结果及其对应的ODn值导入SPSS19.0中绘制ODn值的ROC曲线图，得到ROC曲线下面积为0.900(95％可信区间:0.834-0.967)，标准误为0.034，P＜0.01，当约登指数最大时，敏感度和特异性分别为76.7％和85.2％，FRR为14.8％，假阴性率为23.3％，对应的ODn值为2.505。③通过血浆病毒核酸提取、基因扩增、Sanger测序、序列拼接等成功获得58条具有清晰碱基峰图的1000bp pol区序列，按照既定的混合碱基判读标准对每条序列进行混合碱基判读，计算得到每条序列的测得混合碱基比例(Proportion ofAmbiguous Base，PAB)。以“金标准”即队列随访获得的所有样本分为感染时间，大于一年和小于等于一年的两组分别标记为0和1，然后将每份样本的判读结果及其对应的PAB导入SPSS19.0绘制ROC曲线，得到ROC曲线下面积为0.794(95％可信区间:0.661-0.927)，标准误为0.068，P＜0.01，当约登指数最大时，敏感度和特异性分别为76.5％和73.2％，FRR为26.8％，假阴性率为23.5％，对应的PAB为0.65％。④并联或串联试验可分别提高敏感度和特异性:当LAg-Avidity EIA和SAM两种方法并联用于MSM HIV新发感染判断时所得到的敏感度和特异性分别为96.3％和66.7％，而当两种方法串联并将LAg-Avidity EIA作为串联试验的第一个试验时所得到的敏感度和特异性分别为44.4％和96.7％。⑤LAg-Avidity EIA和SAM联合构建二元Logistic回归模型可同时提高敏感度和特异性:以是否为新发感染为因变量，ODn值及PAB为协变量，进行二元Logistic回归分析，得到回归方程logit(P)=2.592*ODn+1.722*PAB-8.544。通过“金标准”即队列随访将所有样本分为感染时间大于一年和小于等于一年的两组，并将两组判读结果分别标记为0和1，然后将每份样本的判读结果及其对应的logit(P)值导入SPSS19.0绘制logit(P)的ROC曲线图，得到ROC曲线下面积为0.940，标准误为0.039，ROC曲线下面积95％可信区间为0.863-1.000，P＜0.01。当约登指数最大时得到的敏感度和特异性分别为95.1％和88.2％，FRR为11.8％，假阴性率为4.9％，对应的logit(P)值为-0.1345。　　结论：⑴得到LAg-Avidity EIA用于MSM HIV新发感染判断的MDRI为222天，与试剂盒推荐的180天的MDRI明显不一致，因此LAg-Avidity EIA应用于MSMHIV新发感染检测时需要校正MDRI。⑵在HIV感染2年内，LAg-Avidity EIA的ODn值与感染时间有较好的相关性。⑶LAg-Avidity EIA和SAM单独用于MSM HIV新发感染判断的敏感度和特异性均不够理想。⑷LAg-Avidity EIA和SAM并联可提高MSM HIV新发感染判断的敏感度，串联可提高特异性，二者联合的二元Logistic回归模型可同时提高敏感度和特异性。