前言：　　心肌组织细胞中存在着两种不同类型的电压依赖型钙通道，即L型电压依赖型钙通道（L-type voltage-dependent Ca2+ channel，L-VDCC）和T型电压依赖型钙通道(T-type voltage-dependent Ca2+ channel，T-VDCC)。L-VDCC对于心脏具有重要的生理和病理学意义，与某些心血管疾病的发生及治疗密切相关。心肌组织中的L-VDCC由四种亚单位组成，即α1、α2/δ和β亚单位，其中α1亚单位由α1C构成，并由CaV1.2编码，是构成L-VDCC孔道结构的主要跨膜亚单位。α1亚单位细胞浆侧C末端富有磷酸化位点和Ca2+依赖性信号转导的作用基序。采用膜片钳制技术对L-VDCC进行电生理研究发现，以细胞贴附记录模式和内面向外记录模式测定L-VDCC活性时，当用人工生理溶液代替细胞内液时L-VDCC的活性显著降低[1]，这种现象被称为L-VDCC的“run-down”现象，由此推测细胞内存在维持L-VDCC基本活性的物质[2]。目前，已经有许多研究结果用来解释L-VDCC的“run-down”现象，如钙通道的蛋白水解、cAMP依赖性蛋白激酶PKA介导的通道磷酸化产生去磷酸化现象等[3]。　　钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）是机体内一种重要的蛋白激酶，广泛参与机体多种生理活动和病理变化的信号转导过程。心肌组织细胞内激活的CaMKⅡ富集于T管并靠近L-VDCC，同时也存在于肌浆网和细胞核中，在维持细胞内Ca2+稳态方面发挥着重要的调节作用。激活的CaMKⅡ通过多种途径调节细胞内Ca2+的稳态，如通过与L-VDCC的IQ区域结合使其磷酸化，进而使离子通道开放频率增加，钙电流增加[4]，同时通过易化调节扩大L-VDCC对Ca2+依赖性信号通路的反应[5,6];磷酸化肌浆网(sacoplasmic reticulum，SR)上的雷尼丁受体(RYR2)，增加RYR2的开放活性，进而增加瞬时Ca2+释放[7]，同时使兴奋-收缩耦联过程中舒张期SR内的Ca2+回漏至胞浆[8]，SR内Ca2+储备和收缩期释放的Ca2+减少，从而导致心肌收缩功能降低;通过磷酸化胞浆受磷蛋白(phospholamban，PLB)的Thr17位点，解除PLB对钙-ATP酶(SERCA2a)的抑制作用，使Ca2+重摄取增加，进而增加心肌的舒张和收缩功能[9]。CaMKⅡ也可调节心肌组织细胞的其他离子通道，如钾通道和钠通道，进而影响细胞内Ca2+的稳态[10,11]。　　本实验研究的主要目的是明确CaMKⅡ在维持心肌细胞L-VDCC的基本活性方面具有哪些重要的作用和意义。在心肌缺血条件下，CaM、CaMKⅡ和CaV1.2信号通路会发生怎样的变化。　　材料和方法：　　1、材料　　动物:健康Wistar大鼠9～12周龄，每个实验组均为6只，由中国医科大学实验动物中心提供。试剂:DEAE sephadex A50离子交换树脂（Pharmacia公司），CaMKⅡ抗体、P-CaMKⅡ抗体、CaM抗体（Santa Cruz公司），CaV1.2抗体（Sigma公司），GAPDH抗体、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗（北京中杉金桥公司），胶原酶Ⅰ型（Worthington biochemical公司），Trizol reagent（Invitrogen公司），RT-PCR试剂盒、实时定量PCR试剂盒（Takara公司），引物均由上海生工生物工程公司合成，其他药物及试剂为国产分析纯。仪器:Masterflex切向流仪（Millipore公司），AKTAPurifier100蛋白纯化分析仪（Pharmacia公司），Waters Delta600高效液相色谱仪、Biosuite HR-SEC高效液相色谱柱（Waters公司），200B膜片钳放大器、1440A数模转换器(Axon公司)，Nanophoto meter(Implen公司)，XP基因扩增仪（杭州博日科技有限公司），TP800实时定量PCR仪(Takara公司)，PowerpacTM Basic型凝胶电泳仪(Bio-Rad公司)，电泳凝胶成像分析系统(DNR Bio-Imaging systems)。　　2、方法　　牛心肌组织蛋白的提取分离及验证:采用常规的蛋白提取方法提取牛心肌组织蛋白，采用切向流结合离子交换树脂层析的方法进行分离纯化，采用Western blot结合分子排阻HPLC方法验证目的蛋白。　　膜片钳分析:胶原酶急性分离大鼠心室肌细胞，采用膜片钳制技术的细胞贴附记录模式和内面向外记录模式记录大鼠心室肌细胞钙电流。用pClamp10.0软件记录，并以pClamp10.0分析软件和自编的单通道分析软件进行数据分析，单通道电流活性以通道开放概率为指标。通过观察心肌组织蛋白提取物、提取物的不同组分和CaMKⅡ对L-VDCC“run-down”现象的影响，研究其对L-VDCC的调节作用。　　大鼠心肌缺血动物模型的制备及评价:采用大鼠在体结扎心脏左冠状动脉前降支的方法制备心肌缺血动物模型，以结扎瞬间二导联心电图出现S-T段弓背样抬高作为模型成功的评价指标。采用血清酶学指标、TTC染色和HE染色方法进一步评价模型。　　实时定量RT-PCR分析:从正常组、假手术组和心肌缺血组Wistar大鼠左心室中提取总RNA，参照Takara试剂盒说明书进行实时定量RT-PCR操作，目的基因七点标准曲线通过反转录产物五倍稀释物获得。目的基因CaM、CaMKⅡ和CaV1.2的RNA的相对表达水平用目的基因与内参基因拷贝数比值确定。　　Western blot分析:从正常组、假手术组和心肌缺血组Wistar大鼠左心室中提取总蛋白，采用Bradford法测定蛋白浓度，将蛋白调整至同一浓度后上样，进行SDS-PAGE电泳，而后60V恒压2～3 h转印，一抗孵育，二抗孵育，ECL发光显影。目的蛋白的相对表达水平用目的蛋白和GAPDH蛋白相应条带灰度值的比值确定。　　免疫组化分析:取正常组、假手术组和心肌缺血组Wistar大鼠左心室，按常规方法做成石蜡切片。一抗孵育切片，常温30min后4℃过夜。用针对一抗的生物素标记的二抗孵育切片，37℃孵育30min，加SABC孵育，37℃孵育30min。DAB显色后，用苏木素做核复染。采用显微照相系统，通过光镜放大400倍，在同一光强度下摄取图像。　　统计学分析:实验结果以平均值±标准误表示，两组之间比较采用Students t检验，P＜0.05为差异有显著性意义。　　结果：　　一、心肌组织蛋白提取物、提取物的不同组分及CaMKⅡ对L-VDCC具有调节作用　　1、采用切向流技术将牛心肌组织蛋白提取物初步分离成分子量大于300 KD和分子量小于300 KD两部分，采用离子交换树脂柱层析纯化的方法将分子量大于300 KD部分进一步分离成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个组分。分子排阻HPLC法测定结果表明，分子量大于300 KD部分主要含有三个组分，Ⅱ组分的成分较单一。通过Westernblot方法检测分子量大于300 KD部分和Ⅱ组分中含有CaMKⅡ。　　2、采用膜片钳制技术内面向外记录模式，观察牛心肌组织蛋白提取物及其不同组分对L-VDCC“run-down”现象的调节作用。实验结果表明，L-VDCC出现“run-down”现象时，钙通道活性下降至细胞贴附记录模式的0.46±0.15％，而牛心肌组织蛋白提取物使“run-down”的通道活性恢复至细胞贴附记录模式的44.29-±13.51％，与“run-down”相比为差异有非常显著性意义（P＜0.01）;加入CaMKⅡ抑制剂KN-62(1μM)后“run-down”的通道活性仅恢复至细胞贴附记录模式的1.30±0.94％，与未加抑制剂组相比为差异有显著性意义（P＜0.05）。Ⅱ组分可以将“run-down”的通道活性恢复至细胞贴附记录模式的22.70±11.01％(P＜0.05)，而CaMKⅡ可以将“run-down”的通道活性恢复至细胞贴附记录模式的71.59±14.76％(P＜0.05)。　　二、CaM/CaMKⅡ/CaV1.2信号通路在大鼠心肌缺血性损伤中发挥重要作用　　1、大鼠心肌缺血模型制备大鼠在体心肌缺血动物模型，结扎瞬间ECG显示S-T段弓背样向上抬高，表明模型制备成功。血清酶学结果显示，大鼠心肌缺血6h血清中的LDH含量与假手术组比较为差异有非常显著性意义（P＜0.01），而在其他缺血时间点，血清中的LDH含量与假手术组相比无显著性意义(P＞0.05)。模型组大鼠心脏的TTC染色和HE染色结果均可见心肌组织缺血性损伤。　　2、CaV1.2的改变实时定量RT-PCR和结果显示，缺血的6h和1d时间点CaV1.2α亚单位的mRNA表达与假手术组相比无显著性意义(P＞0.05);而在2w和4w时间点表达减少，与假手术组相比为差异有显著性意义(P＜0.05)。Westernblot结果显示，在缺血的6h和1d时间点CaV1.2α亚单位的蛋白表达与假手术组相比无显著性意义(P＞0.05);而在2w和4w时间点表达减少，与假手术组相比为差异有显著性意义(P＜0.05)。　　3、CaMKⅡ的改变实时定量RT-PCR结果显示，缺血的不同时间点CaMKⅡ的mRNA表达与假手术组相比为差异有显著性意义（P＜0.05）。在缺血1d时表达最低(P＜0.01)，而后略有增加，到缺血4w时表达进一步降低（P＜0.01）。Westernblot结果显示，缺血1d和4w时间点CaMKⅡ的蛋白表达与假手术组相比为差异有显著性意义(P＜0.05)。P-CaMKⅡ的蛋白表达变化趋势与CaMKⅡ变化一致。　　4、CaM的改变实时定量RT-PCR结果显示，缺血的6h、1d和1w时间点CaM的mRNA表达增加，与假手术组相比为差异有显著性意义(P＜0.05)。Westernblot结果显示，缺血的6h和1d时间点CaM的蛋白表达与假手术组相比为差异有显著性意义(P＜0.05)，表达增加。　　结论：　　1、心肌组织蛋白提取物逆转“run-down”L-VDCC活性的作用与CaMKⅡ密切相关。　　2、CaMKⅡ具有维持L-VDCC基本活性并逆转“run-down”L-VDCC活性的作用。　　3、大鼠心肌缺血性损伤时，CaV1.2钙通道mRNA和蛋白表达在急性期(6h、1d和1 w)无明显变化;而在慢性期(2w和4w)表达减少。　　4、大鼠心肌缺血性损伤时，CaMKⅡ的mRNA和蛋白表达均减少，而CaM的mRNA和蛋白表达表现为急性期增加，而慢性期逐渐恢复至正常的趋势。